HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的：克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法：从感染HSV-1 F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果：成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论：成功克隆出UL30cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。     

siRNA干扰HSV-1 UL30 DNA聚合酶基因的研究

目的：筛选高效沉默HSV-1UL30基因的siRNA,研究siRNA沉默UL30基因后对HSV-1繁殖的影响。方法：设计并化学合成12对靶向UL30基因的siRNA,与pEGFP-N1-Fi融合表达质粒共转染VERO细胞,流式细胞术筛选高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA对感染细胞内UL30mRNA表达的抑制效果,CPE法和空斑减数实验评价siRNA对HSV-1繁殖的抑制效果。结果：共转染实验筛选出高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA4、siRNA10及siRNA8,这3对siRNA均能显著降低感染细胞内UL30mRNA的表达水平及病变细胞释放到培养上清的子代病毒滴度,siRNA4和siRNA10在感染后36h对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,其病斑分别比对照组减少61.17%、51.46%（P〈0.05）,siRNA4、siRNA10及siRNA8组最终形成的空斑直径分别比对照组减小29.94%、23.49%、21.69%（P〈0.01）。结论：筛选到高效抑制UL30的3对siRNAs,siRNA4及siRNA10在病斑形成早期对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,说明siRNA4、siRNA10及siRNA8均能延缓病斑的扩大和病斑数目的增长,对病毒的繁殖有一定的抑制效果。