单核细胞增多性李斯特菌氨基肽酶Lmo1711体外表达及其酶活分析

对单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)lmo1711基因编码的氨基肽酶进行克隆表达与纯化,并研究该重组蛋白的体外酶学特性。首先通过生物信息学分析预测Lmo1711与氨基肽酶家族成员的亲缘关系及关键活性位点的保守性。利用SWISS-MODEL模拟预测该蛋白的空间结构;构建Lmo1711原核表达载体并转化入E.coli Rosetta中,诱导表达重组目的蛋白,并利用镍离子亲和层析方法纯化目的蛋白;以氨基酸-对硝基苯胺偶联物为底物,Lmo1711通过水解底物N端氨基酸残基产生游离对硝基苯胺单体,405 nm处检测吸光值对该产物进行检测从而分析Lmo1711的酶学特性。在此基础上系统研究Lmo1711对不同氨基酸残基底物的催化特异性,及不同金属离子对该酶活性的影响。经原核表达纯化获得49.3 kDa的重组Lmo1711蛋白,与预测分子量一致;生物信息学分析推测Lmo1711属于M29氨基肽酶家族,且存在保守关键氨基酸活性位点(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380);酶活分析显示,Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性,针对不同底物的结合和催化能力差异较大,对亮氨酸残基的亲和程度最高;Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性,Co~(2+)、Cd~(2+)、Zn~(2+)等多种金属离子均能显著增强其活性,其中Co~(2+)的激活效应最显著。本试验首次发现并证实,单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员,具有较强的催化活性,且对金属离子具有不同程度的依赖性。     

病原细菌调控丝裂原激活蛋白激酶信号介导先天免疫的机制研究进展

信号传导途径使细胞能够对复杂的外界环境刺激及时做出反应,从而针对不同病原菌感染产生生物学效应。丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及其下游靶标作为将环境输入转化为大量细胞程序的最重要信号模块之一,在哺乳动物细胞中最为常见,几乎参与绝大多数细胞的生理和病理反应。MAPK响应各种环境压力刺激,包括细菌感染和炎症,以此调节宿主的免疫反应。近期研究表明,病原菌在感染期间会释放特定效应物或毒素来劫持MAPK通路,劫持方式分为两种,一种是通过降解关键蛋白影响信号传导,更主要的一种是影响宿主细胞翻译后修饰,如磷酸化、泛素化等来调节诸多细胞进程。本文讨论了MAPK在先天免疫中的调节激活过程,并研究病原细菌如何进化出复杂机制来操纵MAPK激活以增强自身感染,以及作为新型抗病原感染和肿瘤免疫治疗靶点的潜在作用。