用人工合成的丁型肝炎病毒抗原多肽检测丁肝病毒IgM抗体及其初步应用

用人工合成的丁型肝炎病毒抗原（ＨＤＶ－Ａｇ）肽建立了检测抗ＨＤＶ－ＩｇＭ抗体的ＥＬＩＳＡ方法,本法操作简便、快速,重复性好,特异性强,与抗ＨＡＶ－ＩｇＭ、抗Ｈｋ－ＩｇＭ、抗ＨＢｓ－ＩｇＭ、抗ＨＣＶ－ＩｇＩ、抗ＣＭＶ－ＩｇＭ、抗ＲＶ－ＩｇＭ、类风湿因子（ＲＦ）及抗核抗体（ＡＮＡ）阳性血清均不起反应,且可被２－巯基乙醇阻断而不起反应。经初步临床应用,３１例正常人血清抗ＨＤＶ－ＩｇＭ全部阴性,２８例慢活肝患者检出率为３２．１％（９／２８）,１７例慢迁肝患者血清阳性率为１１．８％（２／１７）１８例肝癌和肝硬化病人血清阳性率为２２．２％（４／１８）这三组病人与正常对照者相比较均有显著性差异（Ｐ＜０．００１）。此外,抗ＨＤＶ－ＩｇＭ阳性血清的ＡＬＴ值均明显高于正常参考范围,提示在ＨＤＶ感染过程中,患者肝细胞进一步受损。实验结果证明,抗ＨＤＶ－ＩｇＭ是诊断ＨＤＶ感染的重要指标,对ＨＤＶ感染早期诊断具有重要价值。     

用人工合成的丁型肝炎病毒抗原多肽检测丁肝病毒IgM抗全及其初步应用

用人工合成的丁型肝炎病毒抗原（ＨＤＶ－Ａｇ）肽建立了检测抗ＨＤＶ－ＩｇＭ抗体的ＥＬＩＳＡ方法。本法操作简便、快速、重复性好、特异性强,与抗ＨＡＶ－ＩｇＭ＇抗ＨＢｃ－ＩｇＭ、抗ＨＢｓ－ＩｇＭ、抗ＨＣＶ－ＩｇＭ、抗ＣＭＶ－ＩｇＭ、抗ＲＶ－ＩｇＭ、类风湿因子（ＲＦ）及抗核抗体（ＡＮＡ）阳性血清均不起反应,且可被２－巯基乙醇阻断而不起反应。经初步临床应用,３１例正常人血清抗ＨＤＶ－ＩｇＭ全部阴性,２８例慢     

高浓度氯苯优势降解菌的筛选及其降解酶的纯化

[目的]分离纯化出一株高浓度氯苯优势降解菌株,对其所产氯苯降解酶进行分离与纯化,为该菌株及其氯苯降解酶的研究提供理论参考.[方法]利用梯度富集培养技术和无菌滤纸片平板法分离菌株,通过形态特征及16S rRNA基因序列分析初步鉴定菌株,用气相色谱法测定培养液中氯苯浓度,以单位细胞氯苯降解率评价菌株对氯苯的降解能力,以氯苯降解率表示氯苯降解酶的活性.取纯化菌株的发酵酶液制备粗酶液,经硫酸铵梯度盐析、透析脱盐、DE-52离子交换层析、G-100凝胶层析和透析浓缩后,进行SDS-PAGE凝胶电泳检验酶的纯度并测定酶的分子量.[结果]从氯苯长期驯化的成熟期活性污泥中筛选到一株以氯苯为唯一碳源和能源的氯苯优势降解细菌LW13,该菌株在以2000 mg/L氯苯为唯一碳源的无机盐培养基中仍能正常生长,其单位细胞氯苯降解率可达1.37 ×10-10.扫描电镜观察到该菌株细胞大小约为2.3 ×0.8μm,长有数根端生鞭毛.16S rRNA基因序列相似性比较表明该菌株与Lysinibacillus fusiformis(溶藻菌)的相似性达95.5％.所纯化的氯苯降解酶为胞外酶,带正电荷,其分子大小约为57 kDa.整个纯化过程中酶纯化倍数化达8.0倍,酶活回收率达52.51％,酶量回收率达6.57％.纯化后的氯苯降解酶在30℃-55℃和pH在6.0-8.0之间都保持较高的酶活性,其最适反应温度和pH分别在40℃和pH8.0左右.[结论]所分离的氯苯优势降解菌属于Lysinibacillus属菌株,该菌株能有效降解高浓度(500-2000 mg/L)氯苯废水,通过逐级分离纯化,可获得氯苯降解酶纯酶,纯化指标符合分离纯化基本规律,纯化效果较为理想.     

渗透处理对麻栎和栓皮栎种子生物学特性的影响

本研究旨在探究渗透处理对麻栎(Quercus acutissima)和栓皮栎(Q.variabilis)种子生物学特性的影响,分析渗透处理过程中种子内部自由水含量的变化,为麻栎和栓皮栎种质资源开发利用提供理论参考。本研究分别使用浓度为0%、 25%、 50%和75%的PEG-6000溶液对麻栎和栓皮栎种子进行渗透处理,绘制种子含水率变化曲线图,并对萌发指标进行评测;基于差示扫描量热(differential scanning calorimetry, DSC)技术分析不同浓度PEG处理后种子热力学特征变化;使用扫描电子显微镜观察不同浓度PEG处理后胚轴细胞超微结构变化。结果显示去除种皮后的麻栎和栓皮栎种子平均含水率(40.56%、 44.31%)和发芽率(97.77%、 95.55%)均高于带种皮种子的含水率(34.94%、 33.51%)和发芽率(75.00%、 77.78%), 50%PEG对麻栎和栓皮栎种子萌发促进效果最好,75%PEG的效果最差;胚轴结晶起始温度、峰值温度及热焓值随PEG浓度的升高均呈规律性下降趋势;扫描电镜观测结果发现高浓度PEG导致细胞降解,部分细胞出现皱缩...     

长链非编码RNA对骨肉瘤的调控作用北大核心CSCD

骨肉瘤是一类主要发生于长管状骨的原发性恶性骨肿瘤,其主要特征是由肿瘤细胞直接形成不成熟的骨或骨组织。患者具有严重的疼痛症状和软组织肿胀,严重的可导致病理性骨折。由于骨肉瘤侵袭性较高和转移较快,其临床治疗效果较差,且患者具有较高的癌症致死率。尽管目前在骨肉瘤发生、发展的机制研究上取得了较大进展,但关于骨肉瘤的生理、病理机制尚未完全清楚。长链非编码RNA作为非编码RNA的一种,在各类肿瘤的发生和发展中发挥关键性作用;其对骨肉瘤细胞的生长、增殖、迁移、侵袭以及骨肉瘤的发生、发展、耐药性和预后也具有重要的调控作用。因此,明确长链非编码RNA在骨肉瘤中的作用,为进一步探究骨肉瘤的发病机制和临床治疗提供潜在的生物标志物。     

家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统建立

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/Cpf1是第二类 (Ⅴ型) 能够编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统,相比于CRISPR/Cas9基因编辑系统,能够利用5′T-PAM富集区增加基因组覆盖率,具有其切割位点为粘性末端和更不易同源重组修复等诸多优势。基于此,本研究构建了能够在家蚕细胞表达的3个不同来源的CRISPR/Cpf1 (AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1) 表达载体,选择高度保守的家蚕热休克蛋白基因BmHSP60和家蚕ATP酶家族BmATAD3A基因分别设计靶标gRNA,构建gHSP60-266R和gATAD3A-346R基因编辑载体。通过T7E1酶切分析和T克隆测序,鉴定3个Cpf1基因编辑系统AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对靶标基因BmHSP60和BmATAD3A的编辑效率。同时,利用Western blotting分析不同基因编辑系统敲除靶基因后对其BmATAD3A和BmHSP60蛋白翻译的影响。本研究成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统,能够在家蚕细胞中有效编辑家蚕基因组,为家蚕基因功能研究、基因工程和遗传育种开发了新技术与新方法。     

家蚕抗性品系NC99R抗BmNPV作用机制分析

家蚕Bombyxmori是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,由家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的家蚕血液型脓病每年给我国蚕桑产业造成巨大的经济损失。文中拟通过鉴定目前存在的家蚕抗病毒品系NC99R抗性特征,初步解析其抗BmNPV机制,以期为家蚕抗病品系分子机制解析提供一定参考。将对照组大造(Dazao,DZ)品系和实验组NC99R抗性品系家蚕幼虫分别定量添食BmNPV包涵体(Occlusion bodies,OB),计算DZ和NC99R品系对BmNPV的半致死剂量(Median lethal dose,LD50),结果显示DZ品系半致死剂量为1.2×10^5多角体/头,抗性品系NC99R的半致死剂量为1.8×106多角体/头,抗性水平相比对照组提高15倍左右。进一步统计分析DZ和NC99R品系口服感染1×10^6多角体/头和体腔注射1×10^6粒子/头出芽型病毒粒子(Budded virus,BV)后的死亡率,结果显示DZ品系死亡高峰集中在第4–6天,NC99R抗性品系死亡高峰集中在第6–8天,与对照相比延迟1–2 d。通过RT-PCR分析BmNPV DNA拷贝数,显示DZ在口服感染和体腔注射后BmNPV基因组都快速增殖,抗性品系NC99R BmNPV DNA拷贝数缓慢增加。HE染色分析显示DZ和NC99R品系在口服感染前期没有显著差异,感染到96 h,DZ中肠细胞核变大,成脱落趋势;而抗性品系NC99R,细胞核膨大,但细胞排列仍较整齐。RT-PCR分析病毒不同时期基因表达显示抗性品系NC99R在口服感染和体腔注射24h后早期基因ie-1开始下调表达,其他时期基因随即下调表达;最后维持在较低表达水平或消失。     

水质改良剂对日本对虾水质的改良效果

以日本对虾为研究对象, 运用强效水质改良剂和水产专用活菌素两种调水产品 , 旨在说明其在水质调控方面的作用。研究结果表明 : 强效水质改良剂和水产专用活菌素均能够降低水体中氨氮、亚硝酸盐、硫化物的含量, 增加水体透明度、水中溶解氧含量, 调节水体 pH 值。不同之处在于强效水质改良剂使用后, 水体中绿藻数量多 , 蓝藻数量少, 这种水体有益于对虾的成活率提高, 该实验中使用强效水质改良剂的实验组的成活率为 85%; 使用水产专用活菌素的实验组水体中蓝藻数量多 , 绿藻数量少, 此种水体日本对虾生长快, 但成活率相对强效水质改良剂较低为 83%。     

hsc70-4基因促进家蚕核型多角体病毒复制增殖

【目的】热休克应答(heatshockresponse,HSR)是机体细胞应对环境压力的一种重要防御策略,鉴定热休克蛋白在杆状病毒侵染宿主过程中的功能,并揭示其作用的分子机制,为探明宿主与病毒相互作用的分子基础提供理论依据。【方法】通过分子克隆技术对Bmhsc70-4基因进行克隆,并利用BioEdit及GeneDoc对其进行多序列比对分析;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对Bmhsc70-4基因进行过表达和敲除;利用荧光定量PCR技术检测相应基因的表达量;通过对Caspase-9和Caspase-3/7活性的检测确定Bmhsc70-4基因对细胞凋亡的影响;通过免疫荧光验证BmHSC70-4和BmIAP的共定位情况,并进一步通过免疫共沉淀验证它们的相互作用。【结果】Bmhsc70-4基因开放阅读框为1950bp,编码649个氨基酸,在昆虫间具有较高的保守性;BmNPV能够诱导Bmhsc70-4基因上调表达,过表达Bmhsc70-4基因能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmhsc70-4基因能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmhsc70-4基因的表达利于BmNPV的增殖;Bmhsc70-4基因具有抑制家蚕细胞凋亡的功能;荧光共定位显示BmHSC70-4和BmIAP共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;BmNPV侵染过程中Bmhsc70-4基因能够促进Bmiap基因的表达。【结论】Bmhsc70-4基因具有抑制家蚕细胞凋亡的功能,在BmNPV侵染家蚕细胞过程中,能够与BmIAP相互作用,并促进BmNPV复制增殖。     

3D水凝胶压应力模型建立及压应力对成骨细胞的影响

目的:通过建立3D水凝胶细胞模型,采用不同强度、频率、时间对MC3T3-E1细胞进行机械加压干预,进而探讨促进成骨细胞生长的适宜压应力方案。方法:设计不同强度、频率、时间的压应力梯度方案对成骨细胞MC3T3-E1进行干预。加压干预结束后即刻收集细胞,对样本中的ATF4、ALP、Runx2、Osteocalcin、RANKL和RANK mRNA进行定量检测。结果:经统计学分析后发现不同强度和频率对ALP(P0.05)、Runx2(P0.01)交互作用显著。此外,4h加压Runx2的表达量比12h加压的高(P0.05);4h加压RANKL的表达量比12h加压的低(P0.05)。结论:确定了压力强度和频率后,对3D细胞水凝胶模型施加一段时间的压应力发现,以1%强度、0.5Hz频率、4h的压应力干预方案能够促进成骨细胞系的生长。