重组TFPI缺失突变体TFPI1-161在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定

人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI_1-161仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒Pgem 3Zf(-) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI_1-161 基因 ,构建表达质粒Ppic9k TFPI_1-161并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI_1-161,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 20倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI_1-161 表达为TFPI1_1-161 (2 4kD)和TFPI_1-161 (27kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4.8和 4.9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1.4gTFPI_1-161(2.4kD)和1.8gTFPI_1-161 (2.7kD) ,其比活性分别达12880u/mg和12400u/mg.回收率达55%.经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测,重组FTPI_1-161具有良好的抗凝及抑制Fxa活性的作用。为获得大量TFPI_1-161提供了一种廉价高效的的蛋白表达纯化方式。为进一步的基础及临床前研究奠定了基础。     

增强微胶囊在血液中稳定性的研究

目的:通过改进成膜工艺,减少血液中HCO3-对海藻酸钠-ε-聚赖氨酸(ε-AP)微胶囊稳定性的影响,从而增强ε-AP微胶囊在血液中的稳定性,使其能够应用于生物人工肝血浆/血液灌注。方法:改进成膜工艺:在成膜液中添加10 mmol/L的Na HCO3并增加ε-聚赖氨酸反应浓度来制备ε-AP微胶囊,用膨胀度表征其机械强度,荧光标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)检测其通透性能,并以微胶囊的膨胀度变化作为衡量指标,考察微胶囊在Na HCO3溶液和血清中的稳定性。结果:改进成膜工艺制备的ε-AP微胶囊与常规条件制备的微胶囊具有接近的机械强度和通透性;改进成膜工艺能够增强的ε-AP微胶囊在Na HCO3溶液和血清中的稳定性;常规条件制备的ε-AP微胶囊在血清中膨胀度增加了约560%,而改进成膜工艺制备的微胶囊膨胀度仅增加160%,其稳定性显著增强。结论:改进成膜工艺能够增强ε-AP微胶囊在血液中的稳定性。     

基于质谱的磷酸化蛋白质组学: 富集、检测、鉴定和定量

磷酸化是一种调控生命活动的重要翻译后修饰,调控生物的生长发育、信号转导、以及疾病的发生发展．从上世纪80年代开始,质谱应用于蛋白质磷酸化的检测中,极大地推动了磷酸化蛋白质组学的发展．质谱检测拥有高灵敏度、高通量的特点,更重要的是具有位点分辨率,因此基于质谱的磷酸化蛋白质组检测方法得到不断的发展和推广．常见的磷酸化蛋白质组研究,首先对磷酸化肽段进行富集,然后进行串联质谱分析,最后通过搜索引擎对修饰位点进行鉴定和定量．本文从这个三个基本方面,对磷酸化蛋白质组研究进行综述,并对未来研究发展方向进行讨论．     

利用转录调控因子Bas1p和Bas2p协同作用提高酿酒酵母cAMP产量的研究

【目的】研究转录调控因子Bas1p和Bas2p协同作用对重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)胞外c AMP产生的影响,初步优化发酵培养基。【方法】通过共整合表达策略,在c AMP产生菌酿酒酵母G5中超表达Bas1p和Bas2p,摇瓶发酵实验考察了Bas1p和Bas2p协同作用对菌株生长及胞外c AMP产生的影响,进一步考察了酵母粉和蛋白胨含量及前体物腺嘌呤对菌株生长和c AMP产生的影响。【结果】超表达Bas1p和Bas2p使菌株在1×YP培养基中发酵120 h时的c AMP产量较出发菌株提高51.4%,达到2 253.8μmol/L;将1×YP中的酵母粉和蛋白胨含量翻倍(即2×YP培养基)发酵120 h时的c AMP产量提高至4 450.4μmol/L;在2×YP培养基中添加0.5 g/L浓度的腺嘌呤时,c AMP产量进一步提高至5 314.3μmol/L。【结论】强化Bas1p和Bas2p的协同作用及相应地优化培养基组分有助于酿酒酵母胞外c AMP生产。     

地黄DNA分子标记与基因功能研究进展

地黄(Rehmannia glutinosa)是一种具较高药用价值和经济价值的植物。有关地黄的种质资源、遗传育种、种植、化学成分和药效、有效成分的提取和分析、植物组织培养和脱毒快繁等已有很多报道,但地黄核酸分子生物学研究尚少。该文从DNA分子标记、转录组学、基因功能和基因工程技术等方面对地黄核酸分子生物学研究进展进行综述,并分析其发展趋势。     

14个灵芝菌株的酯酶同工酶分析*

对14个灵芝菌株进行拮抗试验和酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳聚类分析,实验共检出迁移率不同的谱带18条,在50%相似水平上聚合为5类,第1类包括仙芝、大仙823、南韩、园芝6号、甜芝、韩芝;第2类包括赤芝10号、赤芝12号、赤芝、日本红芝;第3类包括紫芝和黑芝;第4类为血芝;第5类为白芝。聚类分析结果与形态观察及拮抗试验结果基本一致。实验还说明酯酶同工酶可作为灵芝良种选育的一种有效标记方法,在菌种鉴定、保藏和管理等方面具有重要作用。