产腈水解酶菌株的诱变及培养优化

对实验室保存的1株产腈水解酶的Rhodococcus rhodochrous菌株采用氯化锂进行诱变处理,筛选得到了1株产酶活力较高的菌株tg1-A6。经过优化得到培养基的配方为(g.L-1):葡萄糖10,谷氨酸钠10,酵母膏3,己内酰胺7,MgSO40.5,K2HPO40.75,KH2PO40.75。当培养温度28℃,摇床转速200 r.min-1,初始pH值7.0,通过补加葡萄糖,该菌的腈水解酶酶活可达到26.77 U.mL-1。     

高效测定发酵液中透明质酸含量的改良CTAB浊度法

透明质酸（HA）在保健品、化妆品及临床医疗等领域都具有重要应用,发酵法是HA生产的主要方法。发酵液中HA含量的快速、准确测定对于HA的生产具有重要意义。在原始十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浊度法测量HA浓度的基础上,提出了去除HA与乙酸缓冲液混合后的水浴步骤、降低CTAB试剂浓度（2.5 g/L）以及确定HA-CTAB络合反应时间（5 min）的改良CTAB法。进一步研究了发酵液各成分对改良CTAB方法的干扰,结果表明,葡萄糖、阿拉伯糖、D 葡萄糖酸前体等对CTAB浊度法没有干扰,但Mg2+等具有较为明显的干扰。通过冰乙醇沉淀与改良CTAB浊度法的耦合,实现了发酵液中HA含量的高效测定。     

微生物法生产丙烯酰胺的研究（Ⅱ）——腈水合酶催化反应动力学与失活动力学

以丙烯腈为原料,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学,本研究以自由细胞的酶为催化剂,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明,在这些因素中,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。28℃时酶活为5659u/mL（菌液）,在5℃时的反应速率仅为28℃时的11.72%,相应的表观酶活为663u/mL（菌液）。而在丙烯酰胺45%浓度条件下的酶活大约只有丙烯酰胺5%浓度下的酶活的1/2。经过对不同温度下的反应速度的研究,得到腈水合酶水合反应的活化能为65.57kJ·mol^-1。本文进一步研究了自由细胞状态下,菌体浓度、pH值、温度、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度对腈水合酶失活的影响,得到了失活动力学。结果表明,在这些因素中,对酶失活影响的最主要因素还是温度和丙烯酰胺浓度。尤其当丙烯酰胺浓度到达35%时,酶活下降得很快,在55 h后,酶活几乎为零。而在丙烯酰胺浓度为10%的情况下,55 h的酶活仍然还存在约50%。试验结果还表明,丙烯腈对酶的稳定性的影响很小。经过数据处理,得到的28℃的酶失活速率常数为5℃下的2177倍。经过对温度与失活速率常数的拟合,得到腈水合酶失活反应的活化能为9228kJ·mol-1。     

肿瘤突变特征与病理分型的关联研究

准确评估肿瘤的病理亚型对诊断、治疗和预后至关重要。以往病理亚型的诊断主要依赖HE染色法和免疫组织化学法,而随着测序技术的不断发展,对患者进行基因型和表型特点的个体分析成为可能,将肿瘤病理分型与基因分型结合用于疾病分型、诊治选择和疗效判断的精准医学研究逐渐兴起。不同病理亚型的肿瘤细胞来源、致癌因素和临床表型均不尽相同,其在基因组上会留下特异“印迹”,即突变特征。本研究通过整合癌症基因组数据库(The Cancer Genome Atlas, TCGA)中肾癌、肺癌和食管癌的外显子测序数据,分别对3种肿瘤通过肿瘤基因突变特征进行肿瘤病理分型聚类和预测。首先通过非监督聚类方法将3种肿瘤分别按照24种突变特征进行聚类分析,其次通过随机森林法从24种突变特征中进一步选择对于区分不同病理亚型有显著性的突变特征并进行聚类分析,构建突变特征对3种肿瘤病理亚型的分型模型。在肾癌中,该模型准确率达到了100% (95% confidence interval (CI): 0.93~1.00),肺癌和食管癌中分别达到了78% (95% CI: 0.66~0.86)和84% (95% CI: 0.60~0.97)。以上研究结果表明,突变特征作为新型分子标记物,对肿瘤的病理分型、诊断,尤其是早诊具有一定的参考意义。     

腈水合酶基因克隆与调控表达的研究进展

微生物腈水合酶作为新型生物催化剂得到日益广泛的应用 ,但野生菌株本身存在的酶稳定性差等问题制约了这一绿色工艺的发展 ,基因工程菌为解决这个难题开辟了新的思路。总结了各种菌株中腈水合酶的序列研究进展 ,虽然基因序列和蛋白序列同源性不高 ,但它们都以基因簇的形式存在 ,并具有相同的活性中心序列。归纳了克隆并表达腈水合酶基因的基本步骤和方式 ,并提出几种有效增强重组腈水合酶活性表达的方法。     

全局转录机器工程——工业生物技术新方法

美国和英国的研究人员在2006年1月出版的<科学>杂志上发表文章称: 工业生物技术是一种新的工业制造概念……并将成为一种新的制造技术典 范①.采用以微生物酶或细胞为主体的工业生物技术生产大宗化学品和能源、材料、医药产品,已经成为全世界--尤其是我国解决资源、能源和环境危机的重要手段②.     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

从三角酵母中提取总RNA ,反转录后进行PCR扩增得到D 氨基酸氧化酶 (D AminoAcidOxidase ,DAAO)基因 ,经测序可知 ,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在 99%以上。将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET 2 8a连接 ,转化大肠杆菌TOP 1 0F′,并筛选得到重组质粒pET DAAO ,转化BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,得到重组大肠杆菌BL2 1 (DE3) pET DAAO。对重组大肠杆菌中的D 氨基酸氧化酶进行了诱导表达 ,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明 ,在 2 8℃、菌浓度 (OD6 0 0 ) 1 0、IPTG浓度 1mmol L时 ,DAAO酶活最高达 2 3 3U mL。研究进一步显示 ,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导 ,当乳糖浓度为 2mmol L ,DAAO酶活可达 2 2 7U mL。经过补料分批培养和乳糖诱导 ,DAAO酶活可以达到 1 75U mL。     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)和λ噬菌体裂解基 因(SＲＲz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β羟基丁酸酯(PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明,同时携带vgb、SＲＲz和phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1(pTU14),经过82h的摇瓶补料分批培养,菌体浓度可以高达25.9g/L,PHB百分含量则可在52h时达到95%以上;此外,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发 酵培养和PHB产品的大量积累,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)和λ噬菌体裂解基因 (S RRz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β 羟基丁酸酯 (PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明 ,同时携带vgb、S RRz和 phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1 ( pTU1 4) ,经过 82h的摇瓶补料分批培养 ,菌体浓度可以高达 2 5 9g/L ,PHB百分含量则可在 52h时达到 95%以上 ;此外 ,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发酵培养和PHB产品的大量积累 ,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁 ,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。     

产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达

为了实现GL-7-ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达,将GL-7-ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列,并将其连接到质粒pET-28a,通过筛选得到了表达GL-7-ACA酰化酶的重组菌B121(DE3),pET-ACY。分别考察了诱导温度、菌浓(OD600)、诱导剂IFrG的用量等因素对重组菌表达GL-7-ACA酰化酶的影响。在优化条件下,GL-7-ACA酰化酶酶活可达266U／L。GL-7-ACA酰化酶经一步DEAE-Sepharose纯化即可达到80％的纯度,酶活收率为50％。