应用亲和层析法提纯 鸡马立克氏病病毒pp38基因重组产物

利用鸡马立克氏病病毒(MDV)1型特异单克隆抗体H19致敏Sepharose 4B—cNBr,从感染重组病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒pp38基因重组产物,获得良好效果。提纯的蛋白质在SDS—PAGE中表现出一条分子量约为38kDa的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质条带也能被单克隆抗体H19识别。利用该提纯的重组pp38免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病毒的昆虫细胞Sf9反应,也能和Ⅰ型MDV型感染的鸡胚成纤维细胞反应。     

I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段.再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4.酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失.重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变.     

带有REV-LTR片段的马立克氏病毒重组野毒株与超强毒株致病性和传播性比较

摘要：【目的】GX0101是一株插入了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)-LTR片段的马立克氏病毒（MDV）重组野毒株,本文将其致病性、致肿瘤性和横向传播能力与超强毒参考株（vvMd5）进行比较。【方法】利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA进行检测。【结果】在经抗MDV疫苗免疫的SPF鸡攻毒试验中表明,GX0101株的致死率28.6%和致肿瘤率7.1%均低于超强毒参考株Md5的致死率63.1%和致肿瘤率19.0%。但是,利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA检测表明,     

敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CVI988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较

【目的】比较敲除meq基因的马立克氏病毒(MDV)与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。【方法】本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组,每组30只,分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1;第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens;第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种后5 d后,第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄,记录死亡情况,对死亡鸡只剖检,并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间,检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。【结果】SC9-1株免疫对感染MDV GX0101攻击SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用;CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%,肿瘤率为16.7%;未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%,肿瘤率为6.67%;相比,空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示,淋巴细胞和羽毛囊DNA中,SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显著低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示,SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。【结论】SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。     

我国1999—2003年间ALV—J野毒株gp85基因变异趋势

通过接种鸡胚成纤维细胞（CEF）、间接免疫荧光试验（IFA）和聚合酶链式反应（PCR）,连续五年从全国各地的送检病料中分离到14株J亚群白血病病毒（ALV-J）。为了动态观察ALV-J囊膜表面结构蛋白（GP85）的变异情况,对这14株野毒株的囊膜糖蛋白基因（env）进行了克隆和测序,将它们与HPRS-103株的GP85的氨基酸序列进行了比较,结果表明：ALV-J的囊膜表面结构蛋白发生了很大的变异,而且这些变异主要集中在高变区hr1、hr2和vr3;这些野毒株GP85的氨基酸序列的同源性在86．6％～100％之间（从同一鸡场中分离到的两株ALV-J即BJ00302与BJ0303的同源性为100％,其它毒株之间的同源性均小于100％）;有义突变与沉默突变的比例显示这3个高变区极有可能是免疫选择压作用的位点。     

Ⅰ型马立克氏病病毒不同致病型参考株与中国分离株pp24基因的克隆与序列分析

为了比较Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)的致病型与pp24基因的关系,将Ⅰ型MDV弱毒(mMDV)、强毒(vMDV)、超强毒(vvMDV)、特超强毒(vv MDV)等不同致病型的CVI988、GA、648A、RB1B、Md5和Md11等6个国际参考株,从中国河北、北京、广东和广西等地分离的7个中国分离株和1个中国疫苗毒814株的pp24基因分别做PCR扩增,并将其克隆到pMD-18载体中测序,与国外已发表的BC-1株进行序列比较.结果表明:Ⅰ型MDV的pp24基因非常保守,15个毒株中只出现5个碱基的随机变化,并引起相应的4个氨基酸改变,但与致病型无明显相关;pp24基因ORF的第81碱基出现差异,所有中国株为G,所有不同致病型国外参考株为C,但并未引起氨基酸改变,显示这一碱基差异只是作为MDV地域性分布的遗传标志,而与病毒分离的年代及致病型等因素无关.     

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoR I和Sac I之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphI~HindIII之间,构建成重组质粒pUC-LTR。将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90。重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达。本研究提示,REVLTR能够作为启动子构建表达质粒。     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CV1988／Ripens株、强毒株GA、超剜毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株Jing-1及3个中国野毒株。结果表明：MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96．7％～100％之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99．2％～100％之间。尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。     

传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较

对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析.结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异.其中有一个是真正的超强毒,即GX8/99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多.在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96.8%～99.5%,在氨基酸(aa)水平为96.6%～100%.而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91.7%～93.6%和91.8%～93.2%.说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系.特别是SD-1/97、SD-3/98、JS-30/99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98.4%和98.6%以上,SD-3/99、JS-30/99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100%.然而,致病性特别高的GX8/99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96.8%～97.2%和96.6%～97.9%.相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8/99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异.