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1.
依据牛肝菌属卷边组Boletus sect. Appendiculati内7个物种的核糖体基因rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列比对,设计5对ITS特异引物,分别用于卷边牛肝菌Boletus appendiculatus与亚卷边牛肝菌B. subappendiculatus、卷边牛肝菌与拟桃红牛肝菌B. pseudoregius、华靛牛肝菌B. roseoflavus与卷边牛肝菌B.?appendiculatus、华靛牛肝菌与华美牛肝菌B. speciosus、拟桃红牛肝菌与华美牛肝菌的相互识别。ITS区段的PCR扩增结果表明,5对ITS特异引物皆成功扩增出可用于辨别这些近缘物种的目的条带。但未能设计出ITS特异引物,以识别华靛牛肝菌与桃红牛肝菌B. regius两个近缘物种。 相似文献
2.
目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。 相似文献
3.
4.
目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。 相似文献
5.
目的:观察低氧对间充质干细胞(MSC)成骨相关基因表达的影响。方法:取第2代MSC,分别在常氧和3%氧浓度下培养,采用real-timeRT-PCR检测骨桥蛋白(OPN)、核心结合因子α1(Cbfal)、骨形态发生蛋白(BMP)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达。结果:2种氧浓度下MSC的形态无明显差异,但3%氧浓度下MSC集落形成能力增强。常氧下MSC中Cbfal和BMPmRNA的表达高于3%氧浓度,差异有显著性(P〈0.05);而OPN和VEGFmRNA的表达虽高于3%氧浓度,但差异无显著性(P〉0.05)。结论:3%氧浓度对MSC的形态没有明显影响,但增强其增殖能力,抑制其成骨分化能力。 相似文献
6.
人胰岛素样生长因子Ⅰ在大肠杆菌中的表达研究 总被引:6,自引:0,他引:6
胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一种多功能细胞增殖调控因子,它对许多疾病有较好的治疗作用.为了获得大量的IGF-Ⅰ产品,在测定了IGF-Ⅰ全长序列的基础上,构建了IGF-Ⅰ表达载体pBVIGF,经热诱导表达后,SDS-PAGE分析表明:含有重组表达质粒的菌株可表达出7.6kD的蛋白.研究了不同菌株对IGF-Ⅰ表达的影响.IGF-Ⅰ的表达水平可达15mg/L.重组蛋白主要以包涵体形式存在,进行了初步纯化和复性研究,Western印迹表明重组蛋白具有IGF-Ⅰ的抗原性.并初步建立了IGF-Ⅰ生物活性测定方法. 相似文献
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8.
目的:利用小鼠神经生长因子(mNGF)和纯化的兔抗mNGF IgG,建立mNGF直接竞争酶联免疫检测方法。方法:以亲和纯化兔抗mNGF IgG作为包被抗体,封闭、洗涤后加入用稀释液稀释的不同浓度的标准mNGF或样品液和生物素标记的mNGF混合液,于37℃孵育80 min或室温孵育120 min,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素,洗涤后加入显色液显色,测定D450nm值,通过标准曲线计算待测样品中mNGF含量。结果与结论:建立了mNGF直接竞争酶联免疫检测方法;该方法的灵敏度约20 ng,变异系数为批内≤10%、批间≤15%,回收率为85%~115%;利用该方法检测了3批样品中mNGF的含量。 相似文献
9.
目的:克隆、表达人vasorin(VASN)蛋白。方法:利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2+金属螯合柱纯化。结果:内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论:获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。 相似文献
10.
目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ss DNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。 相似文献