Expression of a Bacillus thuringiensisdelta-endotoxin cry1Ab gene in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis strains that naturally colonize the phylloplane of tomato plants (Lycopersicon esculentum,Mills)

AIMS: To introduce a cry gene into microorganisms that naturally colonize the phylloplane of tomato plants to improve the persistence of the Cry proteins for controlling a South American tomato moth (Tuta absoluta, Meyrick, 1917). METHODS AND RESULTS: A cry1Ab gene isolated from a native Bacillus thuringiensis strain (LM-466), showing a relevant activity against T. absoluta larvae, was cloned into the shuttle vector pHT315 (Arantes and Lereclus 1991). The construct was introduced by electroporation into native Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis strains, both natural inhabitants of the tomato phylloplane. Western analysis and toxicity assays against the target larvae proved that the successful expression of the gene was accomplished in host bacteria. Recombinant toxin displayed a similar LC50 value in comparison to native donor strain LM-466. Both transformed Bacillus survived for at least 45 days on the tomato leaf surface. CONCLUSIONS: Plant-associated microorganisms that naturally colonize the phylloplane could be useful as recombinant microbial delivery systems of toxin genes of B. thuringiensis. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: Modified microorganisms capable of surviving on leaf surfaces for several weeks with insecticidal activity should allow for a reduction in pesticide application.     

基于生物信息学的番茄潜叶蛾味觉受体基因家族特征及发育表达探究

昆虫的味觉受体是一类关键的化学感受器,能够探测外部环境的刺激,并对昆虫的寄主选择、摄食、交配和产卵等行为产生影响。本研究以重大入侵害虫番茄潜叶蛾Tuta absoluta（Meyrick）为研究对象,为明确番茄潜叶蛾味觉受体基因家族（Gustatory Receptor,GR）特征和探讨番茄潜叶蛾不同发育阶段GR家族基因的表达情况,利用生物信息学方法对番茄潜叶蛾GR基因进行鉴定、染色体定位、系统发育分析及龄期表达分析。结果表明,鉴定出番茄潜叶蛾GR基因62个,且分布于19条染色体上,编码蛋白质序列长度为318~2 034 bp,平均外显子（Exon）片段数量为5个,具有1~7个跨膜区。系统发育分析表明,番茄潜叶蛾GR基因可分为4个亚家族,包括苦味受体（35个）、二氧化碳受体（1个）、糖受体（5个）和Gr43a-like受体（7个）,其余基因则未分类。不同发育阶段的表达分析表明,番茄潜叶蛾GR基因在不同发育阶段的表达存在显著差异。研究结果为进一步明确番茄潜叶蛾味觉受体基因功能,揭示其与寄主植物的协同进化关系奠定了基础,这些发现为利用功能植物来控制番茄潜叶蛾提供了科学依据,并为从味觉受体角度开发新的害虫防控技术奠定基础。     

番茄潜叶蛾卵黄原蛋白受体基因TaVgR在生殖发育调控中的作用

【目的】本研究旨在明确卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor, VgR)在番茄潜叶蛾Tutaabsoluta生殖发育过程中的功能,为潜叶类害虫的绿色防控提供候选靶标。【方法】基于番茄潜叶蛾转录组数据,采用RT-PCR扩增TaVgR基因cDNA全序列,并进行生物信息分析;通过RT-qPCR分析TaVgR在番茄潜叶蛾不同发育阶段(1-4龄幼虫、1-7日龄雌蛹和雌成虫)和雌成虫不同组织(头、体壁、前肠、中肠、后肠、卵巢、脂肪体和马氏管)中的表达模式;进一步利用RNAi抑制番茄潜叶蛾雌蛹体内TaVgR的表达,并观测沉默TaVgR基因后番茄潜叶蛾卵巢发育及繁殖力的变化。【结果】克隆获得番茄潜叶蛾TaVgRcDNA(GenBank登录号: MZ682118)序列,其开放阅读框序列长5 496 bp,编码1 831个氨基酸,推测的蛋白分子量约为206 kD,等电点为5.17,信号肽包含N-端前18个氨基酸残基,并具有典型LDLR家族蛋白保守功能域。RT-qPCR结果显示,TaVgR转录水平随着番茄潜叶蛾龄期的增加逐渐上升,雌成虫羽化后达到最高水平;TaVgR在番茄潜叶蛾雌成虫的卵巢中表达量最高。TaVgR RNAi对初期雌蛹中TaVgR的表达抑制率为62.04%~72.55%,导致卵黄蛋白在卵巢中的沉积受阻,卵巢管和卵粒长度缩短,成虫10日单雌总产卵量及后代卵孵化率降低,最终引起番茄潜叶蛾繁殖力下降。【结论】TaVgR基因在番茄潜叶蛾雌成虫和卵巢中高表达,且沉默该基因严重阻碍其卵巢发育和降低繁殖力。本研究为开发以VgR基因作为靶标的鳞翅目害虫防治新技术奠定了理论基础。     

番茄潜叶蛾求偶与交配节律研究

明确昆虫求偶及交配等生殖行为的节律,对于性信息素引诱剂的研发与田间合理应用具有重要的指导意义。本研究对番茄潜叶蛾雌虫的求偶行为和雌雄成虫的交配行为节律进行了探究。结果表明,番茄潜叶蛾雌虫主要在亮期进行求偶,亮期开始前少数个体出现求偶现象,亮期开始求偶率迅速增加,在0.5 h内达到高峰期,高峰期平均求偶率达80%以上。不同日龄求偶率不同,2～3日龄为该虫求偶最活跃龄期。番茄潜叶蛾雌雄间交配主要发生在亮期,亮期0.5 h到达高峰期,交配率达90%,与雌虫求偶高峰期吻合。番茄潜叶蛾雌、雄虫一生均可进行多次交配,雌虫7 d内最高交配4次。相对于雌雄比1∶1,雌雄比1∶2的交配率有所降低,而雌雄比2∶1的交配率和平均交配时长均有所上升。本研究证实了番茄潜叶蛾主要在亮期进行求偶和交配,且求偶和交配行为存在明显的节律性,雌、雄蛾一生均可进行多次交配。     

温湿度对番茄潜叶蛾生长发育及繁殖的影响

番茄潜叶蛾Tuta absoluta Meyrick(鳞翅目Lepidoptera)已经成为中国一种重要的农业害虫.了解温湿度对其发育期的影响对预测其种群动态至关重要.本研究采用两性生命表的方法,在相对湿度10％、25％、50％和75％下测定番茄潜叶蛾化蛹率、羽化率及产卵量,在温度15℃、20℃、25℃、30℃和35℃下测定番茄潜叶蛾各虫态发育历期、世代周期、幼虫存活率、成虫存活率、单雌产卵量等.结果表明,番茄潜叶蛾化蛹率、羽化率及产卵量随着湿度的升高呈现出先升高后下降的趋势,相对湿度75％为其最适发育湿度;在不同温度条件下发育历期随着温度的升高而逐渐缩短,15℃下发育历期最长为63.3 d,30℃恒温下仅为23.6 d,35℃下无法完成世代的发育;雌成虫在25℃条件下繁殖最快,产卵量最高,单雌产卵量为112粒;净增值率、周限增长率随温度的升高先增后减,说明高温和低温均不适合番茄潜叶蛾种群数量增加,25℃是最适发育温度.     

番茄潜叶蛾不同龄期幼虫的肠道细菌群落组成及多样性特征

植食性昆虫肠道细菌的组成与其发育阶段密切相关,并且能为宿主昆虫提供多方面的功能。然而番茄潜叶蛾Tuta absoluta（Meyrick）肠道细菌与发育龄期相关研究鲜有报道,本研究旨在探究番茄潜叶蛾不同龄期幼虫肠道细菌多样性特征及预测其功能。本研究选取番茄潜叶蛾1~4龄幼虫,提取幼虫肠道细菌基因组DNA,利用Illumina MiSeq二代高通量测序技术,分析其肠道细菌多样性和丰度。Alpha多样性分析显示,番茄潜叶蛾1龄幼虫肠道细菌多样性和丰富度最高,且肠道细菌丰富度随龄期增加而降低。番茄潜叶蛾4个龄期肠道细菌的优势门均为变形菌门Proteobacteria,除了4龄幼虫的优势菌属是肠杆菌属Enterobacter以外,其他龄期幼虫的优势菌属是沃尔巴克氏体属Wolbachia。PICRUSt2基因功能预测显示番茄潜叶蛾幼虫肠道细菌参与碳水化合物、氨基酸、能量的代谢,表明其可能在食物消化吸收和营养供给等方面发挥重要作用,其中不同龄期肠道细菌新陈代谢Metabolism功能有显著差异,1龄幼虫功能基因比例明显高于3龄、4龄。研究结果可为探索番茄潜叶蛾肠道细菌与宿主的相互作用奠定基础,也为番茄潜叶蛾的适应性进化和综合治理提供更多的视角和方向。