N-糖蛋白去糖基化酶（PNGase）的研究进展

N-糖蛋白去糖基化酶（PNGase）是一种广泛存在于真菌、植物、哺乳动物中的去糖基化酶，可以水解N-糖蛋白或 N-糖肽上天冬酰胺与寡糖链连接的化学键，并释放出完整的N-寡糖。PNGase在生物体内参与蛋白质降解、器官发育、个体生长等过程。人PNGase基因功能缺陷会导致先天性去糖基化障碍，小鼠PNGase缺陷会导致胚胎致死性，线虫PNGase缺陷使其寿命下降。本文对PNGase在不同物种的分布、蛋白质结构、酶学功能及生物学功能进行阐述，为PNGase的生理病理功能及致病机制的基础研究提供思路，为PNGase作为糖生物学工具酶或药物开发的创新应用研究奠定基础。     

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶的功能与机制

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶（endo-beta-N-acetylglucosaminidase,ENGase）广泛分布于各种生物中,主要通过降解错误折叠的糖蛋白,参与细胞和生命的调控。ENGase也是糖链编辑的有效工具酶,可专一性水解游离寡糖链及糖肽或糖蛋白上核心五糖的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）之间的β-1,4糖苷键。其水解产物是寡糖链和一个GlcNAc,或带有一个GlcNAc的糖肽或糖蛋白。本文对ENGase的发现、分布、蛋白质结构、酶学反应及生物学功能进行阐述,为ENGase的生物学研究提供思路,为糖生物学与糖组学的应用研究奠定基础。     

固定化葡萄糖异构酶最适pH值的调节

用多孔强碱性三乙醇胺基聚苯乙烯树脂作为载体,用CNBr与载体上多羟基作用共价偶联葡萄糖异构酶(GI)。最适偶联条件表明:CNBr量增多,蛋白载量增加,但比活下降。固定化葡萄糖异构酶(IGI)最适反应温度比天然酶提高15℃。并系统地研究了影响IGI活力-pH的曲线的各种因素:用具有不同平均孔径的载体(R=137A,185A,230A,365A)固定化GI,在低离子强度条件下(0.0064mol/L),测定其最适pH值分别7.76,7.56,7.50,8.20。选择平均孔径为230A且具有不同数量三乙醇胺基的载体(0.94,1.05,1.13,1.37mmol/g干胶)分别固定化GI,其最适pH值分别为7.70,7.50,7.46,7.36。     

HIV-1膜蛋白在甲醇型酵母中的表达和抗原性的研究

通过计算机辅助分析了中国广西B/C重组亚型HIV-1病毒株的Env蛋白(共851氨基酸残基)氨基酸的疏水性、潜在的抗原表位,与其它亚型的Env蛋白在氨基酸组成的保守性方面进行了比较,选择了env基因的469-511aa,538-674aa和700-734aa三段保守性及抗原性都较强的氨基酸序列构建成嵌合基因,将嵌合基因构建到毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPICZαB中,利用甲醇诱导表达,对表达的蛋白进行了Wester blot和SDS-PAGE分析,结果表明,三段基因能在毕赤酵母Pichia pastoris中表达,产物为40kD的特异性诱导糖蛋白,通过Ni-sepharose 4B金属Ni螯合层析柱分离纯化表达蛋白,酶联免疫检测结果表明,纯化的抗原有很强的抗原特异性,可以用于HIV检测试剂的研制和开发。     

重组人干扰素α-2b滴鼻剂的研制

重组人干扰素α-2b(rIFNα-2b)滴鼻剂的试制及临床前工作研究.进行了理化和生物学性质试验、稳定性试验、鼻腔局部刺激性试验、急性毒性试验、长期毒性试验和动物体内抗病毒试验等.本品连续三批工艺稳定,检定合格,性质稳定,2～8℃保存24个月后生物学活性无明显下降,使用安全,无不良反应.其它各项试验均符合现行<中国药典>的要求.表明该制剂具有比较好的开发与应用前景.     

SOE-PCR法合成狂犬病毒单链抗体基因Fv57

目的:通过一系列短引物拼接合成狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57.方法:采用SOE-PCR的方法,利用多条短的寡核苷酸引物,经过6轮PCR,拼接合成800bp左右的狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,并利用此方法修正了上述PCR过程中产生的多处突变,从而获得正确的单链抗体基因序列.结果:采用SOE-PCR法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与预期结果一致.结论:成功地利用SOE-PCR法合成了狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,为其下一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达奠定基础.     

CTLA4基因修饰骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化及其免疫抑制功能研究

用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stern cels,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.诱导后的细胞可表达AFP、Alb和CK18等肝细胞标志,同时还具有储存糖原和摄取、排泌靛青绿等肝细胞功能.转基因BMMSCs在未经诱导和诱导后均可表达CTLA4Ig,诱导14天时表达量有所减弱.单向混合淋巴细胞反应证实,诱导7天的转基因BMMSCs具有明显的抑制淋巴细胞反应的作用,其抑制作用明显高于未转基因BMMSCs,且CTLA4Ig基因修饰BMMSCs输注还可以明显延长肝移植大鼠的存活时间.用重组腺病毒Ad-CTLA4Ig对BMMSCs进行基因修饰,一方面不会影响BMMSCs的肝细胞分化潜能,另一方面使BMMSCs的免疫抑制特性得到进一步强化.     

条件复制腺病毒的构建

条件复制腺病毒是针对第一代复制缺陷型腺病毒在临床应用中存在的问题而构建的能在肿瘤细胞特异复制的基因治疗载体。该从其构建机制、构建方式及效力评价等方面论述了为实现特异性高效复制所应考虑的诸多方面的问题,如特异性启动子的选择,基因重组方案的设计,以及相应的效力评价体系的构建等。     

接枝淀粉载体固定化糖化酶的研究

合成了淀粉接枝丙烯腈及丙烯酰胺的两亲性高分子化合物,并以此为载体,用物理吸附方法固定化了糖化酶。最适偶联条件研究表明：缓冲液的浓度,ｐＨ值及吸附时间和加酶量都对固定化酶活力,比活有一定的影响。在最适固定化条件下,固定化酶的活力为１５００Ｕ／ｇ干胶,蛋白载量为２５ｍｇ／ｇ干胶,比活为６０Ｕ／ｍｇ蛋白,比天然酶的比活（８．０Ｕ／ｍｇ蛋白）提高６倍。最适反应温度比天然酶提高１０℃（天然酶最适反应温度为５０℃）．无底物存在下,固定化酶在５５℃的半衰期为２４ｈ,而天然酶只有１ｈ;有底物存在下,固定化酶在５５℃的半衰期为２２０ｈ,４５℃的操作半衰期由外推法算得为６９天,而且该载体对糖化酶有一定的保护作用,当固定化酶在低于５５℃热处理一段时间后,对酶活力有激活作用,酶活力最大可提高４０％。该载体合成简单,固定化方法简单,步骤少,因而为工业上应用提供了一种新的可能性。