基于PIPE现象的质粒克隆位点序列设计与功能评价

分子克隆是现代生物学研究的核心技术之一,是基因工程、蛋白质工程中的重要手段。为提高分子克隆实验的操作效率,本研究设计并合成基于聚合酶引物不完全延伸（polymerase incomplete primer extension,PIPE）现象的质粒克隆位点序列。并以此为基础统一相关引物的设计方案,避免传统酶切--连接法中需针对不同载体MCS序列设计不同引物的缺点。该方案利用13 bp定长接头序列,在同一体系中使用2对引物、2种线性化模板同时扩增载体和插入片段,通过20个循环,在1次PCR过程中即合成可供转化使用的带缺口质粒产物。在NEB Q5酶系统中,利用此法将3种荧光素酶序列插入pET-15b及pET-21b(+)载体,均获得成功。且利用商品化感受态细胞（转化效率 > 5×108 cfu/μg）转化后所获得转化子数量均在300个以上,其中含插入片段的阳性克隆比例可达85%以上。基于本方案的设计及作用原理,可将其应用于10 kb以内载体和插入片段的快速重组。且具有通用性强、耗时少、阳性克隆得率高和成本低等优点,是传统DNA重组方法的有益补充,可作为各实验室的常规分子克隆手段之一。     

18个X-STR在中国北方汉族人群中的突变率研究

从484个北方汉族家系人员中提取获得模板DNA,并用TYPERX19扩增试剂盒检测分析,在5 652次等位基因传递中,有6个基因座(DXS6810,DXS8378,DXS6797,DXS7423,DXS7424,DXS8377)共发生了8次突变,DXS6810和DXS8377的突变率为0. 006 4,DXS8378,DXS6797,DXS7423和DXS7424的突变率为0. 003 2,其他12个基因座未观察到突变,18个X-STR的平均突变率为0. 001 4,所有的突变都是一步突变,各基因座之间的突变率没有显著性差异(P 0. 05),在所有突变中,增加突变和减少突变没有显著差异,X-STR基因座突变率和等位基因长度有关,等位基因重复次数越多越容易突变,大部分的突变来源于父亲。     

基于CRISPR/Cas9技术的基因敲入/敲除策略

成簇的规律间隔性短回文序列(CRISPR)基因编辑系统,因其设计简单操作方便和无种属限制,已成为一种广泛应用的基因组定点编辑工具,在复杂的基因组编辑,例如基因的人源化改造以及条件等位基因的构建中有所应用。在自然界中,CRISPR系统拥有多种类别。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一种。本文针对CRISPR/Cas9系统,分别从基因敲入/敲除片段的大小、同源臂长短、构型即递送方式等技术环节进行综述,阐述不同设计及操作条件下由CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入/敲除的效率差异。     

Erwinia carotovora ssp. carotovora Infection Induced ＂Defense Lignin＂ Accumulation and Lignin Biosynthetic Gene Expression in Chinese Cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）

Erwinia carotovora subsp, carotovora （Ecc） infects and causes soft rot disease in hundreds of crop species including vegetables, flowers and fruits. Lignin biosynthesis has been implicated in defensive reactions to injury and pathogen infection in plants. In this work, variations of lignin content and gene expression in the molecular interaction between Chinese cabbage and Ecc were investigated. H2O2 accumulation and peroxidase activity were detected by 3, 3＇- Dimethoxybenzidine staining at mocked and Ecc-inoculated sites of Chinese cabbage leafstalks. Klason lignin content in inoculated plants increased by about 7.84%, 40.37%, and 43.13% more than that of the mocked site at 12, 24 and 72 h after inoculation, respectively. Gas chromatography detected more p-coumaryl （H） and less coniferyl （G） and sinapyl （S） monolignins in leafstalks of Chinese cabbage. All three monomers increased in Ecc-infected leafstalks, and the Ecc-induced ＂defense lignin＂ were composed of more G and H monolignins, and less S monolignin. After searching the expressed sequence tags （EST） data of Chinese cabbage, 12 genes putatively encoding enzymes involved in lignin biosynthesis were selected to study their expression. All of these genes could be induced by mock inoculation and Ecc infection, while the gene expression lasted for several more hours in the infected samples than in mocked and untreated plants. Our results indicated that ＂defense lignin＂ was different from the developmental lignin in composition; G and S monolignins were significantly induced in plants in response to the soft rot Ecc; thus, lignin biosynthesis was differentially regulated and played a role in plant response to the soft rot Ecc.     

基于分组重量编码的蛋白质功能预测

从蛋白质序列出发,采用分组重量编码(Encoding Based on Grouped Weight,简记EBGW),并结合最近邻居算法对蛋白质功能进行预测。对酵母(Saccharomyces cerevisiae)蛋白质的1826条序列进行预测,整体预测准确率与其他基于序列信息的蛋白质功能预测方法相当。实验结果表明基于EBGW编码方案的新方法可有效地应用于蛋白质功能预测。     

小麦种子中几丁质酶基因的扩增及序列分析

根据http://www.tigr.org中与小麦几丁质酶基因相关的序列TC187877,设计引物,分别从小麦品种Gamenya和苏麦3号中扩增到大小约为1 000bp的片段。经序列测定和软件分析比较,发现这些片段所编码的蛋白质氨基酸序列,都有CHITINASE-19.1和CHITINASE-19.2的基序,为第II类几丁质酶基因。扩增的核酸序列在GenBank上发表,登录号分别为AY973229和AY973230。     

尘螨变应原Derf1核酸序列测定及其分子进化分析

目的:对尘螨主要变应原Der f1进行核酸序列测定,探讨其系统进化信息。方法:根据Genbank公布的Der f1基因序列设计引物,巢式PCR扩增Der f1的cDNA,纯化、回收、克隆至pMD19-T simple后进行序列测定,序列比对后用Clustal W 1.83构建分子进化树。结果:成功扩增出Der f1的cDNA片段,测序表明该基因含ORF1个,长度966bp,与参考序列同源性达99.9%。该变应原具半胱氨酸蛋白酶活性,与果蝇进化关系最远,与梅氏嗜霉螨进化关系最近。结论:成功获得了尘螨变应原Der f1基因片段,根据其编码的氨基酸序列构建出的系统进化树与形态学分类不一致。     

FMR-1基因中CGG重复序列扩增条件的优化

目的:优化PCR扩增条件,建立一种有效检测脆性X综合征的方法。方法:在常规PCR的基础上,采用耐高温酶替代法、碱基替代法,同时加入有机溶剂DMSO等,对表型正常的人群进行FMR1基因CGG重复序列检测。结果:改良PCR法可以提高G C富集区扩增效率,并取得了较好的效果。结论:建立了一种扩增FMR-1基因中CGG重复序列的可行方法。     

后基因组时代的病毒学

人类基因组计划的提出及实施完成了人类基因组全序列的测定,与此同时,其他多个物种的基因组序列也相继被获知[1],加速了学界从分子水平破译人类所有DNA序列和识别其中所有基因的进程.