剑叶龙血树内生放线菌活性菌株的筛选和鉴定

为筛选具有抗菌抗肿瘤活性的药用植物内生菌资源,该文对300余株分离自中国云南西双版纳及越南地区剑叶龙血树的内生放线菌采用琼脂块扩散法进行抗病原细菌活性筛选、平板对峙法进行抗真菌活性筛选、SRB法测定菌株的细胞毒活性及PCR扩增方法筛选非核糖体肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因;对得到的优势菌株经8种培养基进行发酵,采用10种病原细菌、3种病原真菌及2种人肿瘤细胞株测试其发酵粗提物的抗菌及抗肿瘤活性以确定最佳发酵培养基;用16S rRNA基因测序方法初步鉴定5株优势菌株的分类地位。结果表明:初筛得到5株抗菌活性、体外细胞毒活性及NRPS、PKS相关基因表达阳性的菌株S01-S05,其中4株(S01-S04)属于链霉菌属、1株(S05)属于类诺卡氏菌属;菌株经不同培养基发酵后产物的抗菌和抗肿瘤活性不同,其中Streptomyces sp. S04在7种培养基中的发酵提取物对8种测试病原菌均有较强抑制作用,且该菌株用Medium C的发酵提取物对人肝癌Hep G2细胞株抑制率达到100%,为剑叶龙血树内生菌活性成分挖掘及新型抗菌药物筛选奠定了基础。     

基于转录组测序的Cd胁迫下芹菜细胞自噬相关基因的筛选

细胞自噬是植物逆境应答过程中最常见的保护机制之一。动物中,自噬相关基因抵御镉(Cd)毒害的功能研究较清楚,但植物却知之甚少。文中以芹菜品种‘皇后’为试材,采用外源Cd(终浓度为0、2、4、8mg/L)添加营养液水培处理,利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选细胞自噬相关差异基因并进行q RT-PCR验证。结果表明Cd胁迫对芹菜植株产生了明显的毒害作用,并与浓度间产生了量效关系。在筛选的8个差异表达的自噬相关基因中,ATG8a、ATG8f、ATG13、AMPK-1、AMPK-2基因随Cd浓度升高表达上调,ATG12、VPS30和VPS34则先上调后下降,说明自噬相关基因可能通过表达上调增加了自噬小体结构以抵御Cd毒性作用;而高浓度Cd(8mg/L)可能超出芹菜的耐受范围,导致多个自噬基因又出现表达下调趋势。以上结果有助于后期自噬相关基因的功能研究,为进一步探讨芹菜对Cd胁迫的耐性机制提供参考依据。     

血清sST2在心力衰竭诊断、预后中的应用价值

心力衰竭(心衰)的发病率正随着人口老龄化的加速而显著上升,目前仍然是一个重大的公共健康问题。尽管近年来在心衰治疗方面取得了显著成效,但患者的生存率依旧很低,预后差,确诊心衰后5年内死亡率高达50%。如果能够对心衰进行快速有效的诊断并按危险程度进行合理分层,将为临床医生制定治疗方案提供重要的参考依据。生物标志物在心衰的诊断、疗效评估及预后判断方面都具有重要的意义。心力衰竭是一种复杂的疾病,涉及多种生理病理过程。心力衰竭时,神经内分泌系统被激活,同时伴随着血容量和心室壁压力增加,心室肌细胞分泌NT-proBNP/BNP,因此,其可作为心衰诊断和预后生物标志物。然而血浆中NT-proBNP/BNP易受到年龄、性别、体型、左室肥大、心动过速、右心室过载、低氧血症、肾脏功能等诸多因素影响。sST2作为一种新型心力衰竭标志物,近年来备受关注,它不仅能够反映心肌纤维化程度并预测是否发生心室重构,且不受年龄、性别、肾功能等因素的影响,同时具有更低的参考变化值和个体指数,更适合用于连续监测和指导治疗,是评价心力衰竭的理想指标之一。文中对近年来sST2在心衰诊断和预后方面的研究进展进行总结归纳,并对其发展趋势进行展望。     

夏枯草PvGGPPS基因的克隆和诱导表达分析

为探究夏枯草中GGPPS基因的生物学特性及功能,该文在夏枯草转录组测序的基础上设计特异性引物,采用逆转录PCR技术获得夏枯草中GGPPS基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析;采用qPCR法分析PvGGPPS基因在不同外源性物质诱导下在夏枯草果穗中的表达量以及该基因在夏枯草不同组织中的表达量。结果表明:PvGGPPS基因开放阅读框1 092 bp,编码363个氨基酸,理论分子量为38 815.68 D,等电点为5.69。PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域。系统进化树表明PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系。qPCR分析表明,PvGGPPS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA3处理组该基因表达量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。该研究结果为进一步研究PvGGPPS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

白及蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

为揭示白及蔗糖合成酶基因与生长发育的关系,该研究以白及为材料,利用RT-PCR技术同源克隆白及蔗糖合成酶的关键基因SuSy,对SuSy基因的生物学特性及表达特征进行了分析,并利用实时荧光定量PCR检测SuSy基因在不同组织中的表达规律。结果表明:(1)白及SuSy基因长度为2 215 bp,编码737个氨基酸,与铁皮石斛、文心兰和蝴蝶兰的蛋白质氨基酸序列的相似性分别为97%、92%和95%。(2)生物信息学分析表明,SuSy蛋白质序列具有较高的亲水性,与拟南芥SuSy蛋白质氨基酸三级结构一致性为75.2%;系统进化树分析发现,白及SuSy蛋白与铁皮石斛处于同一个分支上。(3) qRT-PCR结果表明,SuSy基因在叶片中的表达量最高,块茎中的表达量最低;成熟叶片的表达量高于未成熟叶片的表达量;数据差异性分析显示,SuSy基因在根、块茎中表达量具有极显著性差异,但在一年生叶和二年生叶中的表达量无显著性差异,幼苗叶和一、二年生叶中表达量具有极显著性差异。由此推测,SuSy基因可能受生长发育的诱导,是调控白及生长发育关键基因。     

马蔺IlWRKY28基因的克隆与表达分析

马蔺(Iris lactea var. chinensis)是鸢尾属多年生草本盐生植物,具有很高的耐盐性和观赏价值。为研究马蔺耐盐的分子机制,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)从马蔺中克隆到一个WRKY转录因子基因IlWRKY28,获得了1 302 bp的全长cDNA序列,其包含一个108 bp 5′末端非翻译区(UTR),一个174 bp 3′末端UTR和一个1 020 bp开放阅读框。IlWRKY28编码339个氨基酸,预测的蛋白质分子量为37.22 kD,等电点为7.04。氨基酸序列分析显示,IlWRKY28包含一个保守的WRKY基序和一个C2H2型锌指结构域。系统发育分析表明,马蔺IlWRKY28与菠萝(Ananas comosus)AcWRKY28和藏北嵩草(Kobresia littledalei)ClWRKY28亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,盐处理后,IlWRKY28基因在马蔺地上部显著上调表达。该研究结果为进一步研究IlWRKY28在马蔺适应高盐胁迫中的功能和作用机制奠定了重要的分子基础。     

金鱼草AmPDS基因克隆及调节类胡萝卜素合成功能分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素进行生物合成途径中的关键酶。为了深入探究金鱼草PDS基因的功能,该研究以‘马里兰’金鱼草(Antirrhinum majus‘Maryland True Pink’)为材料,对其PDS基因(AmPDS)全长序列及蛋白结构进行分析,并克隆了AmPDS基因片段;采用qRT-PCR技术检测AmPDS基因在不同时期及部位的相对表达水平,利用VIGS技术验证AmPDS基因功能,用紫外分光法测定叶片中各类色素含量。结果显示:(1)成功克隆AmPDS基因片段(500 bp);AmPDS基因cDNA全长1743 bp,编码580个氨基酸;其蛋白分子量为64.75 kD,理论等电点6.66;同源比对分析显示AmPDS基因与芝麻(Sesamum indicum)的序列相似性最高。(2)qRT-PCR分析表明,AmPDS基因在全株均有表达,且在全盛期花朵的上瓣和叶片中表达量最高。(3)构建pTRV2-AmPDS载体,建立了金鱼草的VIGS沉默体系,AmPDS基因沉默效率约为53%,与阴性对照相比叶片中各类色素含量均显著降低。研究认为,AmPDS基因是金鱼草类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因,可作为金鱼草VIGS沉默体系的指示基因,为后续研究金鱼草其他基因功能奠定基础。     

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。     

产瓦伦西亚烯酿酒酵母的表达载体适配及发酵碳氮源优化

瓦伦西亚烯是一种倍半萜类化合物,广泛应用于香水、香皂、食品和饮料等工业制造上。但由于其自然含量极低,且目前获取瓦伦西亚烯的方法较为麻烦且花费高,因而构建细胞工厂进行瓦伦西亚烯的生物合成是更为高效和环保的方法。选取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主构建细胞工厂,先在酿酒酵母基因组上引入黄扁柏的瓦伦西亚烯合成酶(Valencene synthase from Callitropsis nootkatensis,CnVS),实现瓦伦西亚烯的初步合成,初始产量为4.16 mg/L。随后利用CRISPR/Cas9系统对酿酒酵母中Mevalonate(MVA)途径的erg9和rox1基因进行敲除,提高通往瓦伦西亚烯合成的碳流量。不同碳氮源浓度发酵的结果表明,细胞生长积累过高可能不利于瓦伦西亚烯的积累。最后探究了不同CnVS表达载体对瓦伦西亚烯产量的影响,并获得17.54 mg/L的最高产量,是出发菌株的4.2倍。     

转基因植物与近缘种之间基因流的研究进展

随着转基因植物的大面积种植,转基因植物的生态风险受到广泛关注,其中主要的风险是转基因植物与近缘物种之间的基因流及其影响。本文综述了目前商业化种植的转基因作物油菜、棉花、玉米和大豆,以及未商业化种植的水稻、小麦的基因流研究进展;分析了不同转基因作物与其近缘种之间发生基因流的频率和最远发生距离;介绍了降低基因流发生的方法。基因流频率受物种亲缘关系、花期重叠时间、风速风向等因素的影响,最远发生距离受气候条件、传粉媒介、地理条件等因素的影响。转基因作物与其近缘种之间的基因流频率与距花粉源的距离呈负相关关系(y=-0.59x-0.46,R²=0.25,P<0.01),亲缘关系近的基因流频率高。为了降低转基因植物与其近缘物种之间的基因流风险,建议采取“分区管理”的策略,并加强基因流发生之后的生态风险评价研究。