重组人源脑红蛋白的高效表达、纯化及鉴定

脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)是新发现的主要表达于脊椎动物神经元及视网膜中的第三类携氧珠蛋白。已有诸多报道认为脑红蛋白在缺氧缺血性脑损伤的神经保护过程中,作为活性氧簇(ROS)的清除剂或缺氧信号的感受器起重要作用,但其神经保护作用的具体机制不明。显然,实现该蛋白的制备对于研究其功能具有重要作用。基于此,通过RT-PCR从人胎脑中扩增出脑红蛋白cDNA并克隆到原核表达载体pBV220,通过测序鉴定正确后转化至大肠杆菌HB101中诱导表达,表达产物超声破碎后经凝胶过滤柱Sephacryl S-200和阴离子交换柱Q Sepharose FF纯化,最后通过Sephadex G-25脱盐。经15% SDS-PAGE和Western blot检测及质谱和蛋白序列分析鉴定制备的蛋白样品为脑红蛋白。本文采用两步法实现了脑红蛋白高效特异性纯化,为后期基于脑红蛋白神经保护作用的功能及机制研究奠定了重要基础。     

一个Ⅱ型甲烷氧化菌中甲烷单加氧酶羟基化酶的分离纯化和理化性质

甲烷氧化细菌能够催化甲烷和一系列小分子烃类化合物的羟基化反应,对控制全球变暖起着重要作用,在工业催化和生物除污中具有非凡的潜能。应用层析方法纯化了Ⅱ型甲烷氧化细菌MethylosinustrichosporiumIMV3011中甲烷单加氧酶的羟基化酶,并对其进行了表征。凝胶过滤法测定了该酶分子量为201.3kD;SDS-PAGE表明羟基化酶含有三个亚基(αβγ),分子量分别为58kD、36kD和23kD,比较两种方法证明该羟基化酶是一个同型二聚体构型(αβγ)2,总分子量为234kD。薄层等电聚焦测定该酶的等电点为5.2。酶的比活力为603.6nmol/(min.mg),活力回收为34.3%。HPLC法测定该酶的纯度在95%以上。原子吸收光谱显示每分子羟基化酶中含有3.02个Fe原子。羟基化酶的稳定性pH值为6.2～7.5,稳定性温度为低于35℃。菌株IMV3011的细胞表观构型呈现了长型、稍微弯曲的杆状形态。     

可溶性尿激酶受体的表达、纯化和结晶

克隆尿激酶受体可溶区域(suPAR)到果蝇胚胎细胞分泌表达载体pMT/Bip/v5-his,重组质粒与pCoHygro共转染果蝇S2细胞,筛选多拷贝稳定表达细胞系suPARS2.suPAR表达蛋白经尿激酶N端片段亲和柱、ResourceQ阴离子交换柱两步纯化后,得到高纯度的、稳定的suPAR单体.纯化后的蛋白质,与其抗体ATN615及尿激酶N端片段结构域等摩尔混合,浓缩至10g/L,以透析法进行该三元复合物晶体生长,获得衍射分辨率为1.9#的蛋白质晶体.     

姜渣的孔隙结构特征及吸附性能研究

采用氮气吸附法通过ASAP2010型比表面积、孔径分布仪测定了提取姜辣素后剩余姜渣的孔径分布及比表面积特征,结合吸附理论对姜渣用于分离纯化姜辣素的可行性进行了分析探讨,用姜渣分离得到了性能优良的姜辣素。     

植物乙醇酸氧化酶分离纯化方法的改进

通过缩短DEAE-Cellulose柱长度,加快流速并采用pH8.8的80mmol.L-1Tris-HCl为洗脱液,可在9小时内快速地从菠菜、菜心和豆角绿叶中纯化得到乙醇酸氧化酶。该酶具高活性(54.6～197.0U.mg-1)及高等电点(pI>10.0)。产率为4.1%～71.5%,纯化倍数为21.6～122.68。经SDS-PAGE检测均有40kD带,表明3种植物乙醇酸氧化酶的亚基大小无区别。     

间斑寇蛛 L.tredecimguttatus粗毒抗血清制备及其活性分析

间斑寇蛛Latrodectus tredecimguttatus是世界上毒性最强的蜘蛛之一,其毒液中含有许多大分子物质,可用于制备抗血清。将粗毒过滤除菌后作为抗原,加弗氏佐剂背部皮下免疫豚鼠。加强免疫3次后经检测抗血清效价达到1：8,再次加强免疫后断颈处死豚鼠放血,分离血清,经饱和硫酸铵分级沉淀及阴离子交换柱层析纯化后,采用westernblot法检测抗体所在峰。离体大鼠输精管电刺激收缩反应实验及活体动物给药实验均表明抗体对毒素具有明显的中和作用。特异性间斑寇蛛毒素抗血清为治疗间斑寇蛛咬伤奠定了基础。     

乳酸菌肽分离纯化研究

采用凝胶层析对乳酸菌粗提液进行分离、纯化,得到乳酸菌肽纯化样品,对其含量、纯度及抑菌效果等指标进行了测定,得到纯化时间在14~18 h所收集的样品含量最高、纯度最高、抑菌效果最好。从而获得了重要的乳酸菌肽研究资料,为今后更进一步的研究打下基础。     

从乙肝疫苗的制备看疫苗纯化技术的发展

疫苗在疾病预防中的地位日益重要,对疫苗质量的要求也日益提高。近年来,在传统和新型疫苗的制备中,应用先进的分离纯化技术是提高疫苗效力降低副反应的有效手段。回顾不同时期乙肝疫苗的纯化方法,概述当今疫苗纯化技术的应用及发展。     

Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗生产工艺参数的研究

疫苗的生产工艺对保证疫苗的质量起着重要的作用,尤其是对生产过程中一些指标的量化显得更为重要。试验的设计分别考察了细胞接种量,细胞培养时间和离心机纯化样品的蛋白含量等因素对疫苗质量所产生的影响。结果显示,对以上指标的控制的最佳量化是接种量3~7×107/瓶,培养时间6 d,样品蛋白含量2000~2500μg/m l。产品质量稳定。     

Comparative studies of acetylcholinesterase purified from three field populations of Liposcelis entomophila (enderlein) (psocoptera: liposcelididae)

Acetylcholinesterace (AChE) is known to be the major target for organophophate and carbamate insecticides and biomolecular changes to AChE have been demonstrated to be an important mechanism for insecticide resistance in many insect species. In this study, AChE from three field populations of Liposcelis entomophila (Enderlein) (Psocoptera: Liposcelididae) was purified by affinity chromatography and subsequently characterized by its Michaelis‐Menten kinetics to determine if detectable changes to AChE have occurred. Bioassays revealed that the potential resistance threat of psocids in Sichuan Province (GH) was greater than either Hubei Province (WH) or Chongqing Municipality (BB). Compared to the other two populations, the WH population possessed the highest specific activity of purified AChE. Kinetic analyses indicated that the purified AChE from GH population expressed a significantly lower affinity to the substrate and a higher catalytic activity toward acetylthiocholine iodide (ATChI) (i.e., higher K_m and V_max values) than BB and WH populations. In vitro studies of AChE suggest that five inhibitors (aldicarb, eserine, BW284C51, omethoate, and propoxur) all possess strong inhibitory effects with eserine having the strongest inhibitory effect against purified AChE. According to bimolecular rate constants (k_i), the purified AChE from GH population was least sensitive to all inhibitors except for omethoate. The differences in AChE among the three populations may be partially attributed to the differences in pesticide application and control practices for psocids among the three locations. © 2010 Wiley Periodicals, Inc.