倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与GenBank中相应酶的序列一致性分别介于92%?100%和87%?100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有LmPH (Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。     

低频脉冲电场对PC12细胞酪氨酸羟化酶和多巴胺合成的影响

运用Western印迹和HPLC分别测定不同时间电场刺激和刺激后不同培养时间条件下,PC12细胞内酪氨酸羟化酶(TH)和细胞培养液中多巴胺(DA)含量的变化。结果显示,受到短时间(5、10min)脉冲电场刺激的PC12细胞,经较短时间(2天)的培养后,细胞内TH的含量和培养液中DA的含量均比对照组有所提高,但随着培养时间的延长(3~5天),TH和DA的含量均明显下降。然而,长时间(15、20、30min)脉冲电场刺激组则先表现为TH和DA的合成受到抑制,但随着培养时间的延长,其合成则被逐渐激活。采用蛋白激酶A(PKA)特异性抑制剂H-89和有丝分裂原活化蛋白激酶的激酶(MEK1/2)特异性抑制剂U0126,研究脉冲电场刺激所激活的与TH和DA合成相关的信号通路。结果表明,在没有神经生长因子(NGF)存在的情况下,PC12细胞主要通过PKA通路来激活TH的合成,低频脉冲电场刺激也主要激活PKA通路,因为抑制这条信号通路能显著抑制电场刺激所诱导的TH合成。     

地高辛精标记酪氨酸羟化酶RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ,Ｄｉｇ）标记的酶氨酸羟化酶（ＴｙｒｏｓｉｎｅＨｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ,ＴＨ）ＲＮＡ探针,本研究用分子生物学技术重组质粒ＰＧＥＭＴＨＩ,即分别将携带Ｔ７和Ｓｐ６启动子的ＰＧＥＭ－３ｚｆ质粒和携带ＴＨ基因的ＰＫＳＴＨ质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带Ｔ７和ｓｐ６启动子的ＤＮＡ片段和ＴＨ基因片段;经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后转入大肠杆菌,得到ｐＧＥＭＴＨ１重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有ＴＨ基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状ＤＮＡ片段,用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ＲＮＡ探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。     

家蚕色氨酸羟化酶(TRH)基因的克隆及表达特性分析（英文）

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是生物界广泛分布的信号分子,涉及动物的重要行为。5-HT是色氨酸羟化酶(Tryptophan hydroxylase, TRH)将L-色氨酸羟化为5-羟-L-色氨酸,5-羟-L-色氨酸随即被多巴脱羧酶(Aromatic L-amino acid decarboxylase, DDC)脱羧而成。TRH作为5-HT合成的限速酶,在无脊椎动物神经调控中具有重要地位。鳞翅目昆虫中TRH的功能研究并不多。在家蚕中克隆了家蚕TRH (Bombyx mori TRH, BmTRH)的cDNA序列1667bp,其中包含1632bp的开放读码框(Openreadingframe,ORF)。人类TPH或者果蝇TRH(Drosophila TRH, DmTRH)与BmTRH有高度相似性,尤其BmTRH和DmTRH之间大多数氨基酸保守说明它们在系统发育上的密切关系并可能有相似功能。基因表达分析显示BmTRH主要表达于头部和中枢神经组织,免疫组织化学和Western blotting结果显示BmTRH只存在于神经组织中,即BmTRH可能仅参与家蚕的神经活动。此外,家蚕DDC(B.moridecarboxylase,BmDDC)和蛋白具有TRH活性的苯丙氨酸羟化酶基因(Phenylalanine hydroxylase, BmPAH)也在中枢神经系统中有表达,暗示家蚕神经系统5-HT的合成与果蝇中不同,可能有两种不同的调控机制。     

Purification and characterization of the rat liver gamma-butyrobetaine hydroxylase

The biosynthesis of carnitine from lysine and methionine involves five enzymatic reactions. -butyrobetaine hydroxylase (BBH; EC 1.14.11.1) is the last enzyme of this pathway. It catalyzes the reaction of hydroxylation of -butyrobetaine to carnitine. This enzyme had never been purified to homogeneity from rat tissue. This paper describes the purification and characterization of the rat liver BBH. This protein has been purified some 413 fold by ion exchange, affinity and gel-filtration chromatographies and appears as a dimere of 43,000 Daltons subunits by PAGE. The affinity chromatography column used in the purification process utilizes 3-(2,2,2-trimethylhydrazinium)propionate (THP), a BBH inhibitor, as the ligand. Polyclonal antibodies were raised against the liver enzyme. They were able to precipitate BBH activity in either a crude liver extract or a purified fraction of the enzyme. Furthermore, it crossreacts with a 43 kDa protein in the liver. No evidence for extra hepatic enzyme was found.     

啤酒废酵母中还原型谷胱甘肽的抽提新方法探讨

采用对羟基苯甲酸酯提取啤酒废酵母菌细胞中的谷胱甘肽（GSH）。研究表明,按菌体与破壁液比例1：2（W／V）加入0．5％的对羟基苯甲酸丙酯,30℃,pH5-pH6,搅拌3h能有效地从啤酒废酵母中提取谷胱甘肽（GSH）,溶液经离心后,上清液中谷胱甘肽（GSH）含量可达96．71mg/100mL。和现有的几种抽提方法比较,对羟基苯甲酸酯提取由于其提取含量高（96．71mg/100mL）、不需要复杂和贵重的仪器、易于放大、经济性强而明显优于其他抽提方法。