肝细胞生长因子基因转染对人淋巴瘤细胞凋亡的影响

探讨肝细胞生长因子（HGF）基因转染人淋巴瘤细胞系Raji细胞后,拮抗足叶乙甙（VP－16）诱导细胞凋亡的研究。将三种细胞：未转染Raji细胞、空载体pVITR02－mcs转染细胞和HGF基因转染细胞,分成正常对照组和经vP－16处理的药物组。采用Westernblot法验证HGF蛋白的表达：CCK－8法检测诱导Raji细胞凋亡的药物浓度;通过透射电镜、流式细胞术、吖啶橙（A0）染色、苏木精咿红（HE）染色等方法观察Raji细胞的凋亡情况,并进行相关分析。结果显示：Westernblot法验证了HGF蛋白质的表达;CCK．8法显示100μg／mL足叶乙甙可明显抑制Raii细胞增殖;透射电镜下可发现典型的凋亡细胞;流式检测结果表明：给药组与正常组相比,三组细胞的凋亡率明显升高（P〈0．01）,提示VP－16具有诱导细胞凋亡的作用：但给药组间：HGF基因转染组凋亡率明显低于未转染组（P＜0．05）和空载体pVITR02．mcs转染组（P〈0．05）,提示嬲F基因转染可明显抑制VP-16诱导的Raji细胞的凋亡,AO染色和HE染色结果也同样提示HGF具有拮抗VP－16诱导的细胞凋亡效应。     

人溶酶体酸性β-葡萄糖脑苷脂酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达

从人胎盘组织提取总RNA,采用RT-PCR扩增人溶酶体酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(Lysosomal acid β-glucosidase,GlcCerase)基因编码区的全部序列,并克隆到pMD-19T载体上,构建克隆载体pMD-GlcCerase.经测序验证后.将GlcCerase亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了人GlcCerase绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-GlcCerase.采用脂质体法将其瞬时转染至COS7细胞系后,在细胞中检测到了GlcCerase基因,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase生物活性的表达.GlcCerase基因的克隆及其表达,为进一步了解GlcCerase基因的功能以及利用转基因动物乳腺生物反应器高效生产GlcCerase奠定了基础.     

稳定表达外源性p16基因肺癌A549细胞株的建立及鉴定

为构建稳定表达外源性抑癌基因p16的肺癌A549细胞株,用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体（pcDNA3)。将抑癌基因p16转移入此基因缺失的人肺癌细胞株A549细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学鉴定p16基因的表达,同时对克隆细胞分泌蛋白进行活性检测。结果显示转染p16基因的A549细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达,说明建立的p16真核表达载体能在肺肿瘤细胞中分泌表达蛋白,表达P16抑癌蛋白的A549细胞株的建立有助于研究抑癌基因p16在肺癌发生中的作用。     

多聚赖氨酸在悬浮细胞转染中的应用

目的:悬浮细胞的转染较贴壁细胞存在一定难度,用多聚赖氨酸包被的细胞培养板培养悬浮细胞使其贴壁,用脂质体2000按照贴壁细胞转染的方法转染悬浮细胞,提供一种高效的转染悬浮细胞的方法。方法:悬浮细胞Jurkat或CCRF-CEM培养于包被了0.1 mg/mL多聚赖氨酸的细胞培养板,16 h后洗掉未贴壁的细胞,用脂质体2000分别将pWPXLd质粒或靶向人ABL1基因的小干扰RNA(siRNA)转染细胞,24 h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白印迹鉴定siRNA的干扰效率。结果:pWPXLd成功转染2种细胞,siRNA成功抑制了ABL1的表达。结论:质粒和siRNA均能成功转染,提供了一种高效可行的转染悬浮细胞的方法。     

尘螨变应原Derf1真核表达载体的构建及转染CHO细胞

目的：构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达。方法：根据Genebank中Der f1基因的核酸序列（AB034946）,设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his A上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定。结果：将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株。结论：成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质。     

无机纳米粒子作为基因载体的研究进展

转染是将具生物功能的核酸转移、运送到细胞内,并使其在细胞内维持生物功能的过程。作为现代生物化学和分子生物学中的一种主要技术手段,转染对于基因治疗有重要的意义。无机纳米粒子作为基因载体受到人们日益广泛的关注,其具有易于制备,可进行多样化的表面修饰等多种优势。本文将概述无机纳米粒子作为基因载体的现状及其对基因表达的影响。     

丙型肝炎病毒NS3基因对人肝细胞生物学特性的影响

目的:建立稳定转染HCVNS3的人源肝细胞系,探讨HCVNS3对肝细胞生物学特性的影响。方法:通过脂质体将HCVNS3的真核表达质粒稳定转染至QSG7701细胞(pRcHCNS3/QSG细胞),PCR,WesternBlot,免疫组化检测基因的整合和表达;光学显微镜和电子显微镜观察转染前后细胞超微结构的改变;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率变化;生长曲线,软琼脂集落实验,成瘤性实验探讨HCVNS3对肝细胞增殖的影响。结果:HCVNS3基因在pRcHCNS3/QSG细胞中得到整合和表达,定位于细胞浆。形态学显示出增殖旺盛的的特点,流式细胞仪检测pRcHCNS3/QSG细胞G0/G1期细胞数目减少而S期细胞数目增加,生长曲线和软琼脂集落实验表明pRcHCNS3/QSG细胞倍增时间明显缩短,停泊非依赖性生长能力明显增强,并能接种裸鼠成瘤,免疫组化证实肿瘤组织有HCVNS3蛋白表达。电镜和流式细胞仪检测显示HCVNS3能促进pRcHCNS3/QSG细胞凋亡。但其促增殖速度远大于凋亡率,表现为pRcHCNS3/QSG细胞获得恶性表型和致瘤性。结论:HCVNS3能明显促进人肝细胞QSG7701恶性转化,pRcHCNS3/QSG细胞可作为研究HCVNS3致癌机理的细胞模型。     

Cloning of infectious adeno-associated virus genomes in bacterial plasmids

We describe the construction of two Escherichia coli hybrid plasmids, each of which contains the entire 4.7-kb DNA genome of the human parvovirus, adeno-associated virus (AAV) type 2. Because the AAV genome was inserted into the plasmid DNA using BglII linkers the entire virus genome can be recovered by in vitro cleavage of the purified recombinant plasmid. Transfection of these recombinant DNAs into an adenovirus-transformed human cell line in the presence of helper adenovirus resulted in efficient rescue and replication of the AAV genome and production of fully infectious virus particles. These AAV-plasmid recombinant DNA molecules should be useful both for site-specific mutagenesis of the viral genome and to study the potential of AAV as a eukaryotic vector.     

氨基葡甘聚糖的质粒DNA转染载体作用的研究

目的 :发展一种新的半人工合成的质粒DNA转染载体。方法 :用氨基化方法将纯化的葡甘聚糖阳离子化 ,用凝胶阻滞检测法 (gelretardationassayforcomplexformation)观察氨基葡甘聚糖 DNA复合物的形成 ,以及用氨基葡甘聚糖作报告基因质粒pEGFP Cl的载体 ,转染HEK2 93细胞 ,观察转染效率。结果 :葡甘聚糖氨基化后溶液离子强度增大 2 0倍左右 ,氨基葡甘聚糖可与质粒DNA形成复合物 ,形成的复合物转染HEK2 93细胞后 ,报告基因pEGFP Cl获得阳性表达。氨基葡甘聚糖最大至 1 0 %仍未显示细胞毒性。结论 :氨基葡甘聚糖可发展为DNA载体系统 ,在HEK2 93细胞中获得理想的目的基因表达。     

人PrP基因体外诱导细胞凋亡的初步研究

朊蛋白为可传播性海绵样脑病的感染因子。将编码朊病毒白的ＰｒＰ标准及突变ＤＮＡ序列分别连接到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１中,并分别转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）。以过ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｄｏｔ ｂｌｏｔ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定证实,得到了稳定表达人标准（ＣＨＯｓ）和终止密码突变ＰｒＰ基因（ＣＨＯｍ）的细胞系。对此细胞系进一步研究发现,带有标准人ＰｒＰ序列的ＣＨＯ细胞系的生长速度比其它对照细胞系