血球凝集素基因编码的流感抗原决定子在大肠杆菌中表达

鸟瘟病毒(fowl plague virus以下写为FPV)血球凝集素分子的基因序列被插入细菌质体中,其转录是在色氨酸操纵子的促进子控制之下进行的。这种质体指导合成一个蛋白质、它能同鸟瘟病毒血球凝集素的抗血清进行特异性反应。在某些情况下,当将此基因在pBR~322的HindⅢ位点插入时,也观察到此基因的表达。     

肺炎克氏杆菌(K.pneumoniae)中的固氮基因区

来源于肺炎克氏杆菌(K.pneumoniae)中的固氮基因位于质体pRDI。它是由寄主范围很广的质体pRDI及肺炎克氏杆菌染色体上一个60 md的片段所组成。     

嗜热链球菌dlt操纵子终端亚基stDltD的晶体结构（英文）

细胞表面多聚物的酰基跨膜修饰对增强细菌的致病性至关重要.DltA/B/C/D操纵子介导的脂磷壁酸(LTA)D-丙酰化修饰是革兰氏阳性菌中重要的一类后修饰,其调节膜内外的电荷平衡.DltA/B/C/D操纵子主要由DltA、DltB、DltC和DltD四种蛋白质亚基组成,其催化机制与结构在生物进化中高度保守.DltA/DltC介导的胞内D-丙酰胺的转移机理已有深入的研究,而跨膜O-酰基转移酶DltB和dlt操纵子末端DltD介导的跨膜催化过程并不清楚.本文解析了来源于嗜热链球菌(S.thermophilus)中stDltD膜外结构域2.94?分辨率的晶体三维结构.结构比对分析表明,stDltD是dlt操纵子终端的酰基转移酶,属于SGNH-like家族,stDltD的活性中心,包括4个blocks和催化三联体,都保守存在于多种革兰氏阳性病原菌中.此外,结构叠合分析表明,stDltD催化中心形成的正电荷窝沟正好可以结合一个脂磷壁酸骨架的单体即甘油磷酸分子.在前人的研究基础上,我们提出了一个由Dlt/A/B/C/D操纵子介导跨膜D-丙酰化修饰的工作模型.本研究对进一步阐明DltD的生物学功能以及...     

苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响

spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σE因子控制的cry1Aa基因表达。     

基于rhaSR嵌合操纵子的穿梭表达载体及其在鱼腥藻细胞中表达的初步研究

通过PCR等基因重组技术,以pKT-215（起源于RSF1010）为载体,构建了带有PR序列（含rhaSR操纵子表达调控元件、rhaR基因、报告基因gst的嵌合操纵子）和PT序列（含rhaSR操纵子表达调控元件及rhaT基因）的二种穿梭表达载体pKT～PTR、pKT—PR。其中,在RhaR基因上游设计和插入了增强的SD序列。首先将pKT—PTR、pKT—PR分别转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,在不同培养基条件下,即舍鼠李糖与不含鼠李糖的培养基中进行表达,紫外分光光度计测定GST蛋白（谷胱甘肽-S-转移酶）的活性。结果表明,含嵌合操纵子的穿梭表达载体能在L-鼠李糖的诱导下表达,gst基因的表达量诱导备件下比非诱导条件下高3倍左右,且表达载体上的thaT基因并不能提高gst的表达;其次,利用三亲结合的方法将2种表迭质粒转入鱼腥藻Annbaena sp．PCC 7120中,抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻,并以转基因藻的质粒DNA为模板进行PCR检测。最后,转基因藻GST酶活力分析结果表明,嵌合操纵子PR在蓝藻细胞中的诱导表达效率极低,表达条件还需进一步优化。尝试将诱导型的操纵子转入蓝藻,具有潜在的应用价值。     

大肠杆菌棉子糖操纵子

大肠杆菌（Ｅscherichia coli）棉子糖（raf）操纵子位于质粒,它编码能够使大肠杆菌吸收和利用三糖棉子糖的蛋白,即一个主动运输系统（Ｒaf透性酶）,α－关乳糖苷酶和蔗糖水解酶。raf操纵子包括启动子rafP,调节基因rafR,操纵基因rafO以及rafA,rafB,rafD三个结构基因。这个操纵子一个阻遏蛋白RafR负控制,同时以环腺苷－代谢降解物基因激活蛋白（cAMP-CAP）为中介的正调控也参与调节。     

布鲁氏菌ery操纵子突变株生物学特性分析

布鲁氏菌ery操纵子参与赤藓醇代谢. 赤藓醇能够促进布鲁氏菌的生长.为进一步研究布鲁氏菌引发宿主流产的分子机制,采用基因重组技术构建布鲁氏菌ery操纵子启动子缺失株（△ery）,通过体内外实验探讨布鲁氏菌ery操纵子的生物学功能. 研究结果显示,获得了布鲁氏菌ery操纵子缺失株;布鲁氏菌ery操纵子缺失株侵染胚 胎滋养层细胞脱落较亲本株明显下降;巨噬细胞CFU计数缺失株作用组和亲本株作用组差异显著（P<0.05）.试管凝集和虎红平板实验结果显示均出现凝集现象;检测血清中细胞因子IL-10和TNF-α的表达水平,△ery诱导机体产生的IL-10和TNF-α明显低于亲本株（P<0.05）.小鼠脾脏细菌CFU计数结果显示,△ery较亲本株毒力明显下降.本研究表明,布鲁氏菌ery操纵子启动子缺失株毒力较亲本株明显下降,为进 一步揭示布鲁氏菌引起流产的致病机制提供了一定的理论依据.     

操纵子前导区的修饰及PRPP合成途径的加强对大肠杆菌积累L-组氨酸的影响

目的:基于转酮酶基因缺失菌株MG1655-ΔtktA,研究启动子替换L-组氨酸操纵子前导区及6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd、PRPP合成酶基因prs的过表达对大肠杆菌产L-组氨酸的影响。方法:通过Red重组系统用T5启动子替换L-组氨酸操纵子前导区;构建gnd和zwf串联表达载体gnd-zwf-pSTV28,prs表达载体prs-pQE30。通过摇瓶发酵,考察上述改造对大肠杆菌积累L-组氨酸的影响。结果:测定结果显示,改造菌株的发酵液中均能实现L-组氨酸积累,平均分别为MG1655-ΔtktA-PT5,60.12 mg/L;MG1655-ΔtktA-PT5(prs-pQE30),66.47mg/L;MG1655-ΔtktA-PT5(zwf-gnd-pSTV28),89.69 mg/L;MG1655-ΔtktA-PT5(prs-pQE30,zwf-gnd-pSTV28),111.56 mg/L。结论:L-组氨酸操纵子前导区的修饰使菌株合成L-组氨酸的能力大大增强,而氧化戊糖磷酸途径的加强和PRPP合成酶活性的提高能够进一步提高产量。     

嗜热链球菌dlt操纵子终端亚基stDltD的晶体结构

细胞表面多聚物的酰基跨膜修饰对增强细菌的致病性至关重要. DltA/B/C/D操纵子介导的脂磷壁酸（LTA）D-丙酰化修饰是革兰氏阳性菌中重要的一类后修饰,其调节膜内外的电荷平衡. DltA/B/C/D操纵子主要由DltA、DltB、DltC 和DltD四种蛋白质亚基组成,其催化机制与结构在生物进化中高度保守. DltA/DltC介导的胞内D-丙酰胺的转移机理已有深入的研究,而跨膜O-酰基转移酶DltB和dlt操纵子末端DltD介导的跨膜催化过程并不清楚. 本文解析了来源于嗜热链球菌 （S. thermophilus）中stDltD膜外结构域2.94 ?分辨率的晶体三维结构. 结构比对分析表明,stDltD是dlt操纵子终端的酰基转移酶,属于SGNH-like家族,stDltD的活性中心,包括4个blocks和催化三联体,都保守存在于多种革兰氏阳性病原菌中. 此外,结构叠合分析表明,stDltD催化中心形成的正电荷窝沟正好可以结合一个脂磷壁酸骨架的单体即甘油磷酸分子. 在前人的研究基础上,我们提出了一个由Dlt/A/B/C/D操纵子介导跨膜D-丙酰化修饰的工作模型. 本研究对进一步阐明DltD的生物学功能以及Dlt/A/B/C/D操纵子酰基跨膜修饰的分子机制具有重要意义.     

质粒拯救法克隆细菌基因组大片段

[目的]细菌基因组大片段尤其是基因簇的克隆与操作,是细菌基因功能分析的一个难点.基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量积累,为细菌基因组:DNA的操作提供了方便.本文报道了利用细菌的全基因组信息和质粒拯救法的原理建立的一种克隆细菌基因组大片段的方法.[方法]首先,根据基因组序列信息,在待克隆片段的一侧扩增一段DNA,并将其克隆到自杀载体上构建打靶质粒,然后,将打靶质粒整合到细菌的基因组中构建重组菌,提取重组菌的基因组DNA,酶切,自连,转化,将自杀质粒与待克隆的目的片段一起拯救出来.最后,根据需要将拯救的DNA片段亚克隆到新的载体中.[结果]我们利用该方法克隆了布鲁氏菌中长度为11kb的virB操纵子,并构建了互补质粒.将该质粒导入到virB的突变株中后使virB操纵子的转录活性得到了恢复,表明该策略切实可行.[结论]这种重组克隆策略给我们提供了一种新的对细菌基因组大片段进行操作的方法.