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31.
丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase, PPDK; EC 2.7.9.1)能够可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)和焦磷酸盐(pyrophosphate, PPi)生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、无机磷酸盐(orthophosphate, Pi)和丙酮酸(pyruvate).以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到了编码PPDK的基因,将此基因片段插入表达载体pET24a (+),在大肠杆菌中表达C端融合His-Tag的重组PPDK.与我们先前表达的N端融合His-Tag的PPDK相比,酶的活性提高了20倍,提示该酶的N端对活性十分重要.重组PPDK单体分子量为98 kD.经过镍亲和层析和超滤后,重组PPDK基本达到电泳纯.重组PPDK与荧光素酶偶联能够形成1个ATP-AMP循环反应,在该循环反应中,荧光素酶催化ATP生成的AMP和PPi能够被PPDK重新转化成ATP,产生一个持续稳定的信号. 相似文献
32.
人细胞质硫氧还蛋白(hTrx1)在抗氧化和氧化还原调控中起重要作用.如果静脉注射重组hTrx1,动物抗氧化能力将增高.近年来,随着人们对氧化还原调控的关注,hTrx1需求不断增加.为了快速获得高纯度重组hTrx1,N末端亲和标签,如组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-tag),被用于hTrx1亲和纯化.带N末端标签的hTrx1融合蛋白在实验中用的越来越多.但N末端延长是否会影响hTrx1特性尚不清楚.我们构建与优化了hTrx1原核表达质粒,在大肠杆菌中高效表达了含天然N末端、带His-tag或带GST-tag的3种重组hTrx1.纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现1条带,对应的分子量分别为12kD、17kD及38kD.在无氧化剂存在时,它们催化胰岛素还原的能力不分仲伯.当有H2O2存在时,天然N末端hTrx1通过形成可逆二聚体,对H2O2表现出较强的耐受性;而N末端亲和标签有干扰二聚体形成,使hTrx1对H2O2耐受性降低的作用,其中GST-tag干扰作用明显大于His-tag.此外,体内重要的氧化还原对GSH/GSSG,有增进hTrx1及其还原酶催化NADPH氧化的作用,N末端亲和标签可明显扩大GSH/GSSG的这种作用.我们分析了N末端亲和标签对hTrx1活性影响的可能机理. 相似文献
33.
McCord的研究结果表明,心肌缺血再灌注性损伤是活性氧自由基——主要是超氧阴离子自由基的毒性引起的。我们的研究证明,ATP-MgCl_2心脏冷停搏保护液在动物实验和临床心脏外科手术中,对缺血缺氧心肌有着十分满意的保护作用。 我们用电子自旋共振波谱仪(ESR)分别检测了以含氧灌注液、含氧灌注液加入SOD和含氧灌注液加入ATP—MgCl_2对离体兔心再灌注时氧自由基的变化,以阐明ATP-MgCl_2是否具有清除活性氧自由基的作用。 相似文献
34.
35.
目的:研究一株自制的c-erbB-2单克隆抗体A18在乳腺癌中表达的特性。方法:应用免疫组织化学SP法、蛋白质印迹分析法和荧光激活的流式细胞分选检测技术检测A18在635例乳腺癌组织、100例癌旁乳腺组织、不表达c-erbB-2的NIH/3T3(鼠成纤维细胞)和NE91(转表皮生长因子受体基因的NR6鼠成纤维面积)细胞株及高表达c-erbB-2的T6-17(转c-erbB-2-基因的NIH/3T3细胞)和SKBR3(人乳腺癌细胞)细胞株中的表达状况,并与市售进口c-erbB-2抗体(MaximBiotech产品)进行了平行对照研究。A18系采用细胞表面区域表位包埋法免疫小鼠制备而成,,结果:A18阳性染色定位于细胞膜,部分伴微弱的细胞浆着色,无明显非特异性染色,A18和进口抗体对NIH/3T3、NE91细胞均呈阴性,T6-17、SKBR3细胞均呈阳性,在乳腺癌组织中,A18的阳性率为60.3%,明显高于癌旁乳腺组织的5.0%,A18与进口同类单抗的阴性、阳性及总符合率分别为84.0%、82.8%及83.2%,与进口同类多抗的阴性,阳性及总符合率分别为88.0%、90.2%和89.5%。A1和进口同类单抗与乳腺癌临床病理特征的关系一致。经反复冻融7次或4℃保存10个月A18效价仍保持在3μg/ml。结论:A18特异性强,定位准确,效价高而稳定、可用于临床乳腺癌的检测。 相似文献
36.
在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据. 相似文献
37.
从中国发病鸡中分离的鸡减蛋综合征病毒(EggDropSyndromVirus,EDSV)弱毒株(AA-2),其基因组全长约为33kb。用限制性内切酶HindⅢ水解EDSV全基因组,构建了以pBluescriptⅡ(KS+)为载体的右末端片段的克隆(约4.2kb),对其进行了序列测定和结构分析。该片段全长4183个碱基对(bp),位于基因组右末端87.3m.u.-100m.u.。结果显示,该片段与哺乳动物腺病毒右末端E4区结构不同,与禽Ⅰ型腺病毒代表株CELO右末端片段亦无同源性。本文为深入了解EDSV基因组结构特点,EDSV与其他腺病毒基因结构与功能的进化关系和EDSV载体的构建奠定了分子生物学基础 相似文献
38.
甘蔗抗逆细胞系选择及其生化特性的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
利用脯氨酸类似物羟脯氨酸(Hyp)的生长抑制作用,筛选出抗Hyp的甘蔗(Saccha-rum sinensis Roxb)细胞变异系R932。抗性系体内游离脯氨酸含量超常积累(×3.2)。而且其体内脯氨酸合成途径中的关键酶γ-谷氨酸激酶对脯氨酸的反馈抑制较不敏感。R932抗PEG和低温能力较供体加强。实验结果表明γ-谷氨酸激酶特性的变化可能导致细胞内脯氨酸的过量积累,脯氨酸的过量积累有利于植物细胞对抗恶劣环境。 相似文献
39.
40.