一个甲基转移酶基因lomo3在洛蒙真菌素生物合成途径中的功能

【目的】洛蒙真菌素是在洛蒙德链霉菌(Streptomyces lomondensis)中生物合成的一种具有广谱抑菌活性的吩嗪类抗生素,但其合成机理仍不清晰。在洛蒙德链霉菌S015的洛蒙真菌素生物合成核心基因簇下游,有一甲基转移酶基因——lomo3,研究该基因对洛蒙真菌素生物合成的影响。【方法】对lomo3基因进行无痕敲除得到基因缺失突变株S015Δlomo3,再过表达重组质粒构建回补突变株S015Δlomo3::lomo3,比较两株突变株与野生型S015的发酵产物的变化。【结果】发现基因缺失菌株S015Δlomo3不能合成洛蒙真菌素,而基因回补菌株S015Δlomo3::lomo3则可恢复洛蒙真菌素的合成能力。【结论】甲基转移酶基因lomo3在洛蒙真菌素生物合成过程中起着重要的作用,但该基因的具体功能还有待深入研究。研究对于阐明洛蒙真菌素的生物合成途径具有一定的指导作用。     

大熊猫肠道芽孢杆菌的分离鉴定及部分生物学特性

【目的】分析大熊猫肠道中芽孢杆菌的种类、纤维素分解能力、抗微生物作用和常用抗生素药物敏感性。【方法】利用芽孢耐高温特性分离菌株,基于16S r RNA基因序列构建系统发育树,通过测量芽孢杆菌在刚果红纤维素培养基上的分解圈分析其纤维素分解能力,采用牛津杯法测定芽孢杆菌的抑菌能力,结合软件分析抑菌能力和进化树之间的关系,通过PCR调查芽孢杆菌的抗菌肽分布规律,最后通过药敏试验检测芽孢杆菌是否对常用抗生素敏感。【结果】共分离得到21株芽孢杆菌;进化树显示,这些芽孢杆菌分为6个类别(Category);羧甲基纤维素钠水解结果显示,所有菌株均能分解纤维素;大部分芽孢杆菌菌株对3种肠道病原菌有较强的抑制能力,聚类分析表明,菌株的抗菌能力与基于16S r RNA基因的分类有一定的关联性;66.67%(14/21)的菌株中可以检测到2个或3个抗菌肽基因;药敏试验结果显示,菌株整体药物耐受率低,仅为7.54%(19/264),但仍有少数菌株对抗生素耐受。【结论】分离菌株种类丰富,分布平均,且均具有纤维素分解能力。21株菌株都含有抗菌肽基因,代谢产物对3种肠道病原菌具有明显抑制作用。常用抗生素耐受性低,对规范临床用药具有指导性。     

金黄色葡萄球菌非编码小RNA的研究进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是困扰全球公共卫生及人类健康的重要病原菌,其引起的各种临床感染与该菌表达的多种毒力因子密切相关,而这些毒力因子表达受到调节性因子的精确调控,在细菌致病机制中发挥着核心作用。非编码小RNA(Small non-coding RNA,s RNA)是基因表达的一类重要调节因子,可使细菌对环境因素做出反应,调节其应激适应性及毒力因子表达。但到目前为止,仅少数金黄色葡萄球菌s RNA的生物学功能得到阐述。本文将针对这些调节性s RNA的研究进展作一综述。     

内参基因加标法定量土壤微生物目标基因绝对拷贝数

【目的】通过荧光定量PCR技术对土壤微生物目标基因进行绝对定量,其定量结果的准确性容易受到DNA提取得率以及腐殖酸抑制性的影响。【方法】采用内参基因加标法,利用构建的突变质粒DNA,对供试水稻土壤样品中的微生物16S r RNA目标基因的绝对拷贝数进行荧光定量PCR检测,用来表征该样品中细菌群落总体丰度。在定量前通过双向引物扩增方法验证突变质粒中的内参基因对供试土壤的特异性。【结果】不同水稻土壤样品的DNA提取量在样品间差异较大。通过内参基因加标法对DNA提取量进行校正,显著提高了16S r RNA基因绝对定量的精确度。不同水稻土壤样品间的变异系数为17.8,与未加标处理相比降低了66.7%。在此基础上,进一步通过内参基因加标法对土壤有机质和含水率均呈现典型空间特征差异的6处亚热带湿地土壤样品中的16S r RNA基因进行绝对定量。16S r RNA基因绝对拷贝数与土壤微生物生物量碳具有显著的线性相关性(R2=0.694,P0.001),表明内参校正后的16S r RNA基因绝对拷贝数可以准确反映单位质量土壤中微生物的丰度。【结论】内参基因加标法可以对DNA提取得率以及腐殖酸对PCR扩增的抑制性进行校正,从而提高绝对定量的准确性。基于内参基因加标法的目标基因绝对定量PCR检测,可作为土壤微生物生物量测量,以及微生物功能基因绝对丰度定量的一种核酸检测方法。     

生物法转化甘油生产1,3-二羟基丙酮的研究进展

1,3-二羟基丙酮(DHA)是一种重要的化工医药中间体,广泛应用于化妆品、医药和食品等领域,开展提高DHA生产效能的研究对于工业生产具有指导意义。甘油生物转化生产DHA是目前主要的工业生产方法,但存在菌株转化效能有待提高、底物和产物抑制、溶氧限制等问题。本文概述了DHA的生物合成途径、菌株改良策略、生产工艺及分离提取等方面的研究进展,指出利用代谢工程技术改造菌种、优化生产工艺、简化分离提纯方法是今后的研究方向。     

小麦赤霉病原菌拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens 7M1产抗菌素的研究

【目的】从小麦根际土壤分离鉴定一株赤霉病拮抗菌,对该菌产的抗菌素进行生物学性质研究、种类鉴定和抑菌实验。【方法】利用牛津杯法和光照培养箱实验对其抑菌活性进行测定,通过16S r RNA基因序列分析对目标菌株的种属进行初步鉴定,根据抗菌素相关基因进行PCR扩增和测序,利用在线软件Pro Param tool和TMHMM对编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】7M1菌体和抗菌素对禾谷镰刀菌的抑菌圈直径分别为16.33±0.13 mm和15.43±0.21 mm,16S r RNA基因序列分析结果显示其为芽孢杆菌,并与解淀粉芽孢杆菌具有较近的亲缘关系,菌株7M1抗菌素对小麦赤霉病的温室防治效果为76.41%,而且热稳定性好,可被蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶降解,在p H 5.0-10.0有较好的抑菌活性,但是紫外线辐射会降低其抑菌活性。菌株7M1含有bac AB、itu C、bam D 3种基因,通过与Gen Bank中相关的抗菌素基因进行比对,发现其编码的氨基酸序列与Gen Bank库中的芽孢杆菌溶素、伊枯草菌素和杆菌抗霉素D等抗菌素的相似性达到99%。bac AB编码蛋白和itu C编码蛋白是稳定蛋白,bam D编码蛋白是不稳定蛋白,此外,3种基因的编码产物不具有明显的跨膜结构。【结论】从该菌发酵液提取的抗菌素有很好的抗禾谷镰刀菌活性而且性质稳定,因而在小麦赤霉病的生物防治中具有潜在的应用价值。     

九香虫(椿象)体内可培养细菌的多样性分析

【目的】认识药用昆虫九香虫(Aspongopus chinesis Dallas)成虫体内可培养细菌资源多样性。【方法】运用纯培养法、反转录重复因子扩增(BOXA1R-PCR)分析技术、16S r RNA基因测序和系统发育分析对样品中可培养细菌进行多样性研究,测定了分离菌株的抗菌特性、吲哚乙酸(IAA)含量和产淀粉酶活性等指标。【结果】通过6种不同培养基共分离得到52株菌落特征不同的细菌菌株。基于菌落特征和BOXA1R-PCR图谱选取12株代表菌株用于16S r RNA基因序列测定。16S r RNA基因序列系统发育分析显示,52株菌株分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)4个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。分离到的52株细菌有44株(占总分离菌株的84.6%)表现出对供试病原菌具有较好的抑制作用,高达94.2%的分离菌株能产IAA,有43株(占总分离菌株的82.7%)表现出淀粉酶活性。【结论】九香虫内细菌种群较为多样,具有潜在应用价值。     

突变肠杆菌株NRS-1中5个草甘膦逆境应答基因的克隆与功能研究

【目的】微生物对草甘膦的抗性受复杂的遗传体系调控,涉及靶基因和大量相关调控基因。对肠杆菌属细菌NRS-1突变菌株在高浓度草甘膦逆境下的5个重要差异表达基因进行功能研究,以期深入了解非靶标基因在抗草甘膦微生物的作用特点,为发掘优异基因资源,服务抗草甘膦转基因生物育种提供参考。【方法】NRS-1的差异表达基因可能在蛋白质合成、代谢、细胞膜等水平发挥作用,保护细胞免受高浓度草甘膦逆境,因此分别选取易位酶延伸因子fus A、丁二酸脱氢酶sdh A、胸苷磷酸化酶deo A、鸟氨酸氨甲酰转移酶arg F、周质蛋白osm Y进行克隆,采用大肠杆菌原核表达、转化拟南芥实验研究其功能,并通过细菌双杂及KEGG pathway分析基因间互作特点。【结果】在明确5个基因结构特点基础上,通过大肠杆菌原核表达及转基因拟南芥鉴定,发现这5个基因及草甘膦的靶基因5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因aro A对提高2种生物的草甘膦耐性均有不同程度的作用,其中arg F、deo A的抗性较好,与aro A相当,表明在应对草甘膦逆境时,芳香族、含有胸腺嘧啶氨基酸及精氨酸的合成代谢通路可能起重要作用;利用基因互作与KEGG分析发现5个基因与靶基因aro A间形成复杂的调控网络,但无直接的蛋白互作。【结论】NRS-1的5个差异表达基因对草甘膦逆境具有抗性,arg F、deo A优于其他3个基因,其与靶基因aro A间表现复杂的基因互作关系。     

小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7 细胞中的表达

目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况。方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBI3和p28 c DNA。采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,msc IL-27),并将其克隆至pc DNA3.1(+)载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pc DNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBI3、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符。在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 m RNA的表达。结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础。     

维生素A棕榈酸酯眼用凝胶联合聚乙烯醇滴眼液对干眼症患者泪液中 IL-1β与TNF-α水平的影响及其临床疗效

目的:探讨维生素A棕榈酸酯眼用凝胶联合聚乙烯醇滴眼液对干眼症患者泪液中IL-1β及临床疗效的影响。方法:选取2013年11月~2015年11月于我院治疗的干眼症患者60例,随机分为实验组和对照组,每组30例。对照组患者给予聚乙烯醇滴眼液治疗,实验组患者在对照组基础上加用维生素A棕榈酸酯眼用凝胶治疗。观察并比较两组患者治疗前后泪液中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、泪膜破裂时间(BUT)、泪液分泌试验(SIT)及角膜荧光素染色(FL)结果,以及临床总有效率。结果:与治疗前相比,两组患者治疗后泪液中IL-1β及TNF-α水平均降低,差异具有统计学意义(P0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后泪液中IL-1β及TNF-α水平较低,差异具有统计学意义(P0.05);与治疗前比较,两组患者治疗后BUT及SIT评分均升高,而FL评分均降低,差异具有统计学意义(P0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后BUT及SIT评分较高,而FL评分较低,差异具有统计学意义(P0.05);实验组临床总有效率高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:维生素A棕榈酸酯眼用凝胶联合聚乙烯醇滴眼液治疗干眼症积极有效,值得临床上大力推广。