绿色荧光蛋白基因导入胡萝卜愈伤组织并获得表达

目的:将绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)重组到胡萝卜愈伤组织细胞中,使其获得表达,为今后利用GFP基因作为植物报告基因提供条件。方法:通过冻融法将含有GFP基因的重组表达载体PBI1121转入到根癌农杆菌EHA105中,再利用根癌农杆菌介导的方法将GFP基因导入到胡萝卜愈伤组织细胞中,经过除菌和抗性筛选后观测转化结果。结果:荧光显微镜观测到被转化的愈伤组织在受蓝光激发后发出绿色荧光,利用PCR法扩增出约740bp的目的基因片断。结论:GFP基因在胡萝卜愈伤组织细胞中获得了表达。     

A Primary Study of the Subgroups of T Lymphocytes in MHV-3 Induced Chronic Viral Hepatitis

To study the contribution of T cell subsets in the pathogenesis of Murine hepatitis virus Type 3(MHV-3) induced chronic viral hepatitis in C3H/Hej mice,ninety C3H/Hej mice were chosen to individually receive 10 plaque forming units(PFU)of MHV-3 intraperitoneally.The changes of virus titer and pathology in liver tissue were examined by standard plaque assay and by the hematoxylin/eosin(HE) staining method from 2 days post MHV-3 infection.The ratios of T cell subsets including CD3 CD4 CD8-,CD3 CD4-CD8 ,CD3 CD4-CD8-,CD3 CD4 CD25 ,CD3 CD4 CD25-and CD3 CD4-CD25 T lymphocyte of total T lymphocytes in blood,spleen and liver were examined at 0,2,4,6,8,10,12,15,20,25,30,40 days post MHV-3 infection by flow cytosorting.We observed that the virus titer raised and showed persistent virus duplications and inflammatory changes in the livers of C3H/Hej mice from 2 days post MHV-3 infection.The double negative T cell(DN Treg cell) and CD4 CD25 T cell ratios increased significantly from 2 days post MHV-3 infection in C3H/Hej mice,and CD3 CD4 CD8-,CD3 CD4-CD8 ,CD3 CD4 CD25-and CD3 CD4-CD25 T cell ratios decreased accordingly.In conclusion,the changes of virus titer and pathology in the livers of C3H/Hej mice post MHV-3 suggest their contribution to viral persistence.Further characterizations of DN Treg cells are that infection indicates that MHV-3 could induce the chronic inflammation in livers of C3H/Hej mice.The increase of the DN Treg cell and CD4 CD25 T cell ratios in C3H/Hej mice post MHV-3 infection suggests that DN Treg cells and CD4 CD25 T cells may both have important suppressive immunomodulation functions in the development of chronic viral hepatitis and have important roles in the virus persistent infection.Further characterizations of DNT cell and CD4 CD25 T cell are under investigation.     

荧光标记法初探植物乳杆菌ST-Ⅲ对Caco-2细胞的粘附机理

利用荧光探针CFDA-SE标记植物乳杆菌ST-Ⅲ,测定其对Caco-2细胞粘附能力的变化,提取相关物质,探讨其粘附机理。化学和酶处理ST-Ⅲ菌悬液发现,经胃蛋白酶、胰蛋白酶、氯化锂、苯酚、盐酸胍和热处理能显著降低ST-Ⅲ的粘附性,表明表面蛋白或脂磷壁酸(Lipoteichoic acid)可能参与了ST-Ⅲ对Caco-2细胞的粘附。粘附抑制试验和可逆性结合实验证实表面蛋白而非脂磷壁酸参与了ST-Ⅲ对Caco-2细胞的粘附。结果表明ST-Ⅲ的表面蛋白粗提物可能含有粘附素类的S-层蛋白(S-layer protein),经SDS-PAGE电泳分析,此粗提物主要成分的分子量分别为72.7、34.1和24.3kD。     

苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1的克隆及表达谱分析

有证据表明昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)与其嗅觉识别密切相关,起着运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体的关键作用.为了更好地了解OBPs在苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus (Goeze)嗅觉识别中的作用,本研究首次克隆了苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1 (GenBank序列号GQ477022). 测序和序列分析结果表明,该基因开放阅读框长438 bp, 编码145个氨基酸,预测分子量为15.69 kDa,等电点为5.01,N-末端疏水区包含由18个氨基酸组成的信号肽.蛋白特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸残基.利用RT-PCR和Real-time PCR技术对Alin OBP1在苜蓿盲蝽成虫不同组织和各个发育阶段的表达水平进行了测定,结果显示Alin-OBP1几乎全部在触角中表达.不同发育阶段Alin-OBP1表达量不同,在5龄若虫和成虫阶段表达水平最高.结果提示Alin-OBP1可能在苜蓿盲蝽感受包括性信息素在内的外界化合物的过程中发挥着重要作用.     

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

利用斜纹夜蛾Spodoptera litura培养细胞,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的3株斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)（K-3、G1-2和G10-3）进行了生物学活性和分子生物学的初步研究,克隆了多角体蛋白基因,并进行了序列分析和比较。结果表明:（1）SpltMNPV日本分离株K-3、G1-2和G10-3分别具有不同的特征性酶切图谱,分别属于3种基因型（A型、B型和C型）; （2）3个分离株的芽生型病毒（budded virus）产生能力和多角体产生能力有差异,免疫印迹分析表明,多角体蛋白的分子量也不同;（3）日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由747个核苷酸编码序列（编码249个氨基酸）组成,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为98.9%,与其他6种核型多角体病毒有较高的同源性（61.7%～74.2%）,但其5′端侧翼序列(nt-1～-100)与AcMNPV和BmNPV相比差异显著,在对该基因表达调控起决定性作用的8个高度保守核苷酸序列中（nt-44～-51）有2处发生自然突变。     

C_2H_2型锌指蛋白研究进展

遗传信息的实现过程离不开基因表达的调控 ,至今为止发现的转录调控因子中有很多含有锌指模体 (ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆ)结构。锌指蛋白是指含有通过结合Ｚｎ2 稳定的短的可以自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质。由于其自身的结构特点 ,可以选择性的结合特异的靶结构 ,使锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用。自从 1 983年在爪蟾卵母细胞中发现第一个具有基因转录调控作用的锌指蛋白ＴＦⅢＡ以来 ,在多种生物中发现的锌指基因已有约 50 0多个 ,其中人基因组中的锌指蛋白基因达 2 0 0多个。…     

妊娠血清标志物的联合检测在预测胚胎停止发育中的价值

目的:探讨血清孕酮(p)、妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、血管内皮生长因子(VEGF)在胚胎停止发育的早期诊断和预测的价值.方法:选择100例孕龄在6～7周的单胎孕妇,追踪85例妊娠结局,据妊娠结局分为正常妊娠组68例,胚胎停止发育而自然流产者为胚胎停育组17例;检测血清P、PAPP-A、VEGF水平,建立ROC曲线,评价指标的诊断价值.结果:(1)胚胎停育组血清P和PAPP-A、VEGF水平均显著低于正常妊娠组(P＜0.001).(2)P与PAPP-A呈正相关,P与VEGF呈正相关(p＜0.001).(3)以P＜14.996ng/ml、VEGF＜26.505pg/ml为临界值,二者联合检测可使胚胎停止发育诊断阳性率达94.12%,特异性为88.2%.结论:血清P、VEGF联合检测敏感性高,对胚胎停育的早期诊断和预测有一定价值.     

针对多效蛋白基因的小干扰RNA的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计多效蛋白基因特异性的小干扰RNA(siRNA),并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNA的表达质粒,以便为在体外研究多效蛋白基因的功能打下基础。方法:设计并合成具有多效蛋白基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencer3.1-H1hygro载体;用脂质体LipofectAMINE2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应siRNA的一组Pten-/-细胞克隆;利用Northern印迹检测这些细胞内多效蛋白基因的表达情况。结果:设计并构建了3个针对多效蛋白基因的siRNA表达质粒,并证明其中的1种质粒能在Pten-/-细胞内稳定表达相应的siRNA,并显著地抑制了该细胞多效蛋白基因的表达。结论:设计并构建出的针对多效蛋白基因的siRNA表达载体所表达的siRNA具有较强的RNA干涉功能,为多效蛋白基因的功能研究奠定了实验基础。     

番鸭呼肠孤病毒YB株σB蛋白的基因序列分析及其原核表达

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是造成雏番鸭高死亡率的重要病原体,深入其检测与免疫研究对于防控DRV感染意义重大。利用RT-PCR和测序技术,对3株福建DRV分离株的S3基因进行序列分析,发现DRV-YH、YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)遗传距离较近,同源性高达94.6%～98.9%,而DRV-YB株与ARV同源性仅为60.6%～61.7%。构建和鉴定DRV YB株重组原核表达质粒pET-30a-S3,并转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE表明,表达的目的蛋白分子量约为42ku,IPTG最适诱导浓度为0.1mM,最适诱导时间为5h,最适诱导温度为37℃,以包涵体形式存在。薄层扫描显示重组DRVσB蛋白占菌体总量的67.7%。以Ni 2+柱亲和层析纯化蛋白,纯化后的目的蛋白纯度为93%,质量浓度为0.86g/L。Western blot分析该融合蛋白能与抗DRV阳性血清发生特异性反应,表明重组DRVσB蛋白具有良好的免疫反应性。     

植物锌铁转运蛋白ZIP基因家族的研究进展

金属离子对植物的正常发育至关重要,但过量又会中毒.植物体内的自动调节平衡机制会调节金属离子的吸收和运输,从而控制金属离子的含量.锌铁调控蛋白ZIP( ZRT,IRT-like protein)家族是广泛存在于植物中的转运蛋白,具有Ca2+、Fe2+、Mn2+及Zn2+等多种金属元素的转运功能.了解ZIP转运体在植物中如何发挥离子转运功能,从分子水平认识金属离子缺乏或过量积累的机理有重要意义.综述拟南芥、水稻、大麦、苜蓿和玉米ZIP家族成员及其研究进展.