柑橘青霉菌CYP51B基因和上游调控区克隆及生物信息学分析

【目的】克隆柑橘青霉菌(意大利青霉菌,Penicillium italicum)CYP51的同源基因,并对基因序列进行生物信息学分析。【方法】通过PCR及染色体步移技术得到基因的完整序列及上下游调控序列。通过生物信息学手段对基因的结构进行分析:使用NNPP分析软件预测转录起始位点,并利用TFSEARCH1.3软件分析转录因子结合位点。利用SWISS-MODEL在线软件对蛋白进行同源模建。【结果】克隆得到了意大利青霉菌CYP51的同源基因,命名为Pi CYP51B。获得的Pi CYP51B及上下游调控区序列总长为3 496 bp,包括上游910 bp和下游834 bp的序列。Pi CYP51B基因的开放阅读框全长1 575 bp,编码524个氨基酸。该基因含有3个分别为74、51、52 bp的内含子,分别位于247 bp与320 bp之间,519 bp与569 bp之间,1 635 bp与1 686 bp之间。Pi CYP51B 5′上游调控区序列的总长为579 bp。生物信息学分析结果显示:转录起始位点位于上游458 bp处;上游调控区不仅包含启动子的核心结构序列TATA盒(位于-25 bp处),也包含多个转录因子结合位点,如Abd-B、ADR1、AP-4、GATA-1、Cdx A、Clox和Oct-1等。在上游调控序列中嘌呤含量高,而且从+387 bp处开始存在4个连续高嘌呤含量的热激转录因子特异性结合位点(HSF);在+106 bp处开始存在3个连续的Cdx A转录因子结合位点。选用人CYP51晶体结构(PDB ID:3LD6)为模板,利用SWISS-MODEL在线软件构建了意大利青霉菌CYP51B蛋白的结构模型。【结论】克隆了意大利青霉Pi CYP51B基因,其上游含有多个热激应答转录因子特异性结合位点(HSF)表明其参与逆境应答。该基因作为意大利青霉菌CYP51的同源基因,可能与青霉菌对真菌药物的抗药性密切相关。     

PRMT5在癌症中的研究进展

蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferases,PRMTs)是真核生物中常见的一种酶,可催化组蛋白和非组蛋白底物中的精氨酸残基发生甲基化.在人类的基因组中,PRMTs由9个基因编码.作为最主要的Ⅱ型精氨酸甲基转移酶,PRMT5是PRMT家族成员之一,参与了包括信号转导、转...     

猪苓菌丝形成菌核的MAPK基因克隆及表达分析

【目的】克隆药用真菌猪苓MAPK基因并进行生物信息学分析及表达模式研究。【方法】利用5′-RACE-PCR技术从猪苓菌丝中克隆得到MAPK基因全长,利用生物信息学软件推测蛋白的理化性质、结构域;DNA Star对氨基酸进行多序列比对;用MEGA 5.0做进化关系分析;借助实时定量PCR检测基因表达模式。【结果】猪苓MAPK基因的全长cDNA为1 293 bp,其中编码区占1 161 bp,共编码386个氨基酸,推测分子量为43.872 kD,理论等电点为6.68。猪苓的MAPK有MAPK中ERK1/2类型的保守区。系统进化树结果显示猪苓MAPK蛋白属于担子菌类群。实时荧光定量PCR分析结果表明猪苓菌核形成初期,菌核中的MAPK表达量显著高于菌丝组织,随着菌核的快速生长而减少。【结论】猪苓MAPK基因PuMAPK的分子特征为进一步研究其在猪苓菌丝形成菌核过程中的作用奠定基础。     

喉鳞状细胞癌组织miR-1207-5p、miR-186-5p表达水平与PI3K/Akt信号通路、临床病理特征和预后的关系

摘要 目的：探讨喉鳞状细胞癌（LSCC）组织miR-1207-5p、miR-186-5p表达水平与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、临床病理特征和预后的关系。方法：选取2017年1月至2020年1月南充市中心医院收治的120例LSCC患者,取手术切除的LSCC组织和癌旁组织。检测miR-1207-5p、miR-186-5p、PI3K mRNA、Akt mRNA表达。患者出院后随访3年,统计总生存（OS）和无复发生存（RFS）情况。分析miR-1207-5p、miR-186-5p与PI3K、Akt的相关性以及影响LSCC患者预后的因素。结果：LSCC组织miR-1207-5p、miR-186-5p表达低于癌旁组织（P＜0.05）,PI3K mRNA、Akt mRNA表达高于癌旁组织（P＜0.05）。LSCC组织miR-1207-5p、miR-186-5p表达与PI3K mRNA、Akt mRNA表达呈负相关（P＜0.05）。肿瘤直径≥1 cm、低分化、TNM分期Ⅲ期、颈部淋巴结转移LSCC组织中miR-1207-5p、miR-186-5p表达低于肿瘤直径＜1 cm、中高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无颈部淋巴结转移（P＜0.05）。miR-1207-5p低表达、miR-186-5p低表达LSCC患者3年总生存（OS）率和无复发生存（RFS）率低于miR-1207-5p高表达、miR-186-5p高表达LSCC患者（P＜0.05）。多因素COX回归分析显示TNM III期、颈部淋巴结转移是LSCC患者复发和死亡的危险因素（P＜0.05）,高miR-1207-5p、高miR-186-5p是保护因素（P＜0.05）。结论：LSCC组织中miR-1207-5p和miR-186-5p表达均下调,与LSCC恶性病理特征、PI3K/Akt信号通路激活以及低生存率有关。     

哺乳动物TET2蛋白氧化5-甲基胞嘧啶的结构生物学研究

DNA甲基化是表现遗传学最重要的修饰之一,哺乳动物的DNA甲基化修饰主要发生在胞嘧啶第5位碳原子上,称为5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5mC）。     

细胞周期蛋白依赖性激酶在miR-193a5p调控卵巢癌细胞增殖及上皮细胞间充质转变中的作用*

目的: 探讨miR-193a-5p靶向CDK14并调控卵巢癌细胞OVAC的增殖和上皮间充质转变(EMT)的作用。方法: 通过TargetScanHuman分析miR-193a-5p与CDK14的匹配情况,通过荧光素酶报告系统检测miR-193a-5p靶向CDK14情况;在miR-193a-5p mimics过表达或者miR-193a-5p inhibitor基因沉默miR-193a-5p的情况下,采用免疫印迹检测CDK14,EMT相关蛋白质E-cadherin、vimentin、fibronectin和N-cadherin的表达量,采用CCK-8检测卵巢癌细胞OVAC增殖情况, MMT检测卵巢癌细胞OVAC的细胞活力。结果: miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR;过表达miR-193a-5后, CDK14的表达下降,EMT相关蛋白质E-cadherin的表达上升,vimentin、fibronectin和N-cadherin的表达下降,卵巢癌细胞OVAC的增殖和细胞活力均增加;同时,基因沉默miR-193a-5p后, CDK14的表达上升,EMT相关蛋白质E-cadherin的表达下降,vimentin、fibronectin和N-cadherin的表达量上升,卵巢癌细胞OVAC的增殖和细胞活力均减少。结论: miR-193a-5p通过靶向CDK14的3‘UTR降低卵巢癌细胞OVAC的增殖、细胞活力和EMT。     

木薯及其他植物P5CS基因进化及表达分析

该研究采用生物信息学的方法,从木薯等31个已完成基因组测序的植物中,共鉴定出84个吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,并对其进行系统发育分析。结果表明:(1)P5CS在内含子长度上差别较大,而在氨基酸长度、外显子数目、等电点和分子量上差别不大。(2)由于发生基因重复,在大多数单子叶和双子叶植物中都有2个P5CS,而且在单子叶和双子叶植物中均发现P5CS1基因聚类在一组,而P5CS2基因聚类在另一组,支持P5CS1和P5CS2基因是独立起源,且该重复事件发生在单子叶和双子叶植物分化之前。(3)在某些植物(如蒺藜苜蓿、大豆等)中存在3~7个P5CS基因,表明在单子叶和双子叶植物分化之后P5CS基因又发生了多次重复事件,并将它们归纳为4种进化模式。(4)木薯中有2个P5CS基因,表达分析显示,MeP5CS1和MeP5CS2在叶片、叶柄、茎、须根和储藏根中均可检测到,其中MeP5CS1在叶片中表达较高,而MeP5CS2在茎和储藏根中表达较高。(5)干旱胁迫下,MeP5CS1仅在第一片完全展开叶中被显著诱导,而MeP5CS2在第一片完全展开叶和老叶中均能被显著诱导;低温胁迫下,MeP5CS1和MeP5CS2在不同组织中均能被显著诱导,但具有不同的表达模式。研究表明,木薯的MeP5CS1和MeP5CS2基因在转录水平受到干旱、低温等非生物胁迫的调控。     

B淋巴细胞信号转导相关接头蛋白Bam32与Hic-5的相互作用

32kDB淋巴细胞接头分子(Bam32)是调控B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)信号转导通路的关键蛋白质分子之一.为了研究Bam32的功能及其作用机理,应用酵母双杂交技术筛选了能与Bam32相互作用的蛋白质分子.筛选发现1个呈强阳性反应的克隆,其基因编码Hic5,为paxillin蛋白家族成员之一.Paxillin是整合素(integrin)信号转导通路中的关键蛋白质分子,而整合素在细胞对细胞外基质分子的粘附、细胞运动等方面起了重要的作用,因此对Bam32与Hic5的相互作用进行了进一步研究.用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实,Bam32可在哺乳动物细胞中与Hic5共沉淀,证明它们可以在细胞内相互作用.应用免疫共沉淀法和抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示,激酶Lyn可导致Bam32和Hic5的磷酸化.这些研究结果提示,Bam32与Hic5的相互作用可能在激活下游分子的信号转导级联反应以及调节细胞的粘附和运动等功能中发挥了重要的作用.     

植物反转录转座子及其在功能基因组学中的应用

高等植物中的反转录转座子是构成植物基因组的重要成分之一.它分病毒家族和非病毒家族两类,病毒家族包括反转录病毒和类似于反转录病毒的非病毒转座子,病毒家族中的反转录转座子可再细分为Ty3-gypsy类和Ty1-copia类;非病毒家族可细分为LINE类和SINE类.正常情况下大部分反转录转座子不具有活性,某些生物或非生物因素胁迫可激活部分反转录转座子转座.反转录转座子自身编码反转录酶进行转录,以"拷贝-粘贴"的转座模式导致基因组扩增和进化.具有活性的反转录转座子通过插入产生新的突变,可作为一种基因标签技术,应用于功能基因组学研究,并成为研究植物基因功能和表达的重要技术平台.本文综述了近几年来在植物反转录转座子方面的研究进展,主要包括植物反转录转座子的结构、特征、活性及其对基因组的影响和它们在功能基因组学中的应用.     

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶ d型新城疫病毒基因组末端序列及分析

[目的]简化cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,fLAcE)流程,测定基因Ⅲ、VIb)和VIId型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析.[方法]利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和eDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增.[结果]建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV 3'末端leader和5'末端trailer序列比对分析.[结论]本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5'端trailer与3'端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因Ⅲ型和VI型NDV均未发现该突变.通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3'末端形成一个发卡结构.JS/7/05/Ch等3株NDV U→C(T→C)的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3'-UCUC-5',与基因组3'端发卡环的3'-UCUUA-5'相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度.