TaqMan-MGB探针检测文森巴尔通体博格霍夫亚种实时荧光定量PCR方法的建立及应用

【目的】应用TaqMan-MGB探针技术,建立具有种水平特异性、高敏感性的荧光定量PCR方法,用于快速检测文森巴尔通体博格霍夫亚种。【方法】在序列特异性扩增区标记(Sequence characterized amplifiedregion,SCAR)技术基础上,依据文森巴尔通体博格霍夫亚种一段特有的基因序列设计探针和引物,分别优化扩增反应的退火温度、探针和引物的反应浓度;分析此方法的特异性、敏感性及重复性;绘制标准曲线,评估PCR反应的扩增效率和稳定性。【结果】本研究设计的TaqMan-MGB探针具有种水平特异性;最低检出限为每个PCR反应11个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.12%-0.70%和0.14%-0.55%,在允许范围内;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率高(E=104.7%)。【结论】本研究建立的基于TaqMan-MGB探针技术的荧光定量PCR方法能够在种水平特异性、高灵敏度检出文森巴尔通体博格霍夫亚种,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

多重连接探针扩增方法在假肥大性肌营养不良产前基因诊断中的应用

假肥大性肌营养不良(Duchenne/Becker muscular dystrophy, DMD/BMD)是一种由于DMD基因突变导致的X连锁隐性致死性遗传病。目前没有有效的治疗方法。为建立一种既可以对携带者进行检测又可以进行产前基因诊断的方法, 文章联合应用多重连接探针扩增技术(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)和短串联重复序列(Short tandem repeats , STR)为遗传标记连锁分析的方法对26例有高风险再生育患儿的假肥大性肌营养不良家系的孕妇通过羊水穿刺进行产前基因诊断。26例进行产前基因诊断的羊水标本中有7例诊断为男性患儿, 4例诊断为女性携带者。MLPA可以作为筛查DMD基因缺失和重复突变的首选方法。联合应用MLPA和STR连锁分析, 可以提高假肥大性肌营养不良的产前基因诊断率。     

植物对铅胁迫的耐性及其解毒机制研究进展

植物对重金属元素的耐性、积累特性是利用植物修复铅污染土壤的前提,因而需要全面理解植物对铅吸收、转运、积累和解毒的一系列生理机制.本文从植物自身对铅的适应和防御机制出发,综述了细胞壁和液泡在植物细胞钝化与铅积累中的功能;根系分泌物对铅生物有效性的影响;超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷光苷肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和植物螯合肽、谷胱甘肽在铅解毒中的作用,以及金属硫蛋白和铅特异基因表达的研究进展.并对未来该领域的研究以及铅污染环境植物修复技术的发展进行了展望.     

黄土高原半湿润区刺槐树干液流对人工截留降雨输入及环境因子的响应

随着全球气候变化加剧, 局部地区温度上升和降水量改变将对区域植被的分布与生长产生重要影响。在黄土高原半湿润及半干旱地区植被恢复中, 刺槐(Robinia pseudoacacia)是大面积种植的人工林树种。为探究该树种蒸腾耗水特征对降水量改变及水分条件差异的响应, 于2015年4月起, 在地处黄土高原半湿润区的陕西省永寿县槐平林场, 于35年生刺槐人工林样地中布设了人工截留降雨试验, 减少了47.5%的降雨输入。处理当年生长季内, 截留降雨处理区0-100 cm土层的平均土壤含水量相对于对照区(23.76%)有明显降低(22.59%)。采用Granier热扩散探针对截留降雨处理区和对照区的样树树干液流动态进行连续监测, 并同步监测主要气象环境因子(太阳辐射、空气温度和湿度)和林地土壤含水量, 分析了截留降雨处理区与对照区树干液流通量密度动态特征及其对环境因子的响应。结果表明: 截留降雨输入处理降低了刺槐树干液流通量密度, 截留降雨处理期间典型天气的平均液流通量密度(1.64 mL·m ^-2·s ^-1)不仅低于同组样树在处理前一年同期的水平(2.42 mL·m ^-2·s ^-1), 而且远低于试验期间对照区样树的平均水平(3.38 mL·m ^-2·s ^-1); 同时, 截留降雨处理还降低了刺槐液流通量密度对气象因子变化的敏感性, 截留降雨处理区样树液流通量密度响应空气水汽压亏缺的拟合方程参数值与对照区样树差异显著。分析可知, 降水量水平不仅影响土壤水分状况, 而且影响刺槐对气象环境因子响应的敏感性, 降水量减少导致的土壤含水量整体降低会使得该区域刺槐蒸腾耗水量下降, 显示其对环境因子的适应性, 但最终会导致生产力的大幅度降低。     

人结核分枝杆菌特异性核酸探针制备及结核病PCR检测技术的初步临床应用

采用人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis TB)染色体DNA为模板,选择位于插入片段IS6110中884～865和568～588碱基对处的两个片段为引物,扩增出317bp的特异性片段．将其克隆进pUCl9载体。酶切图谱分析和DNA序列测定证实为目的片段。该片段经DIG标记,分别与11种分枝杆菌DNA进行Southern杂交,结果证明只与人型复合分枝杆菌发生杂交反应。利用该对引物建立的PcR检测拄术对74份结核病痰液标本进行检测,并与临床细菌快速培养结果相比较,发现48份临床阳性均为PcR阳性,在26份临床阴性标本中亦发现11份PCR检测阳性。将标本PCR产物与克隆探针进行杂交,显示两者结果完全一致。说明PCR检测体系结果可靠,其灵敏度明显高于目前临床所采用的方法,可作为一种常规技术用于结核病的临床检测。     

探针检测:大海捞针

使DNA探针技术商品化不能顺利进行的主要障碍,在于需为检测探针发展一系列简单、安全和灵敏的检测技术。小段DNA不发送自己的信号,所以研究工作者设法把信号分子耦联到探针上,而不损伤它们与互补序列杂交的能力。信号分子包括荧光抗体、能使染料改变颜色的酶和化学发光催化剂。     

一种快速精确测定Tth DNA聚合酶活性的方法

Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶,但在生产和改造过程中,缺乏准确、快速、简便测定酶活的方法.利用高灵敏度双链特异性核酸染料PicoGreen和特殊设计的发夹型探针,建立了一种测定Tth DNA聚合酶活性的新方法.该方法的标准曲线线性关系良好,决定系数R2达到0.99以上,灵敏度...     

基于Taqman-MGB探针的亚稀褶红菇实时荧光定量PCR检测方法

本研究建立了一种基于Taqman-MGB探针的亚稀褶红菇Russula subnigricans实时荧光定量PCR检测方法。根据亚稀褶红菇与其近似种的内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）序列差异,设计合成1对引物和1条特异性Taqman-MGB探针,并用常见有毒红菇种类进行验证。结果显示,引物特异性良好,仅亚稀褶红菇出现荧光信号,完成整个检测过程只需2h。该法能够为毒蘑菇中毒的快速检测提供技术支持。