RNAi介导的OsBTF3基因沉默及其对水稻籽粒相关性状的影响

为了创制OsBTF3基因沉默的水稻植株、验证该基因在水稻籽粒相关性状中的功能、评价其在水稻遗传改良中潜在的应用价值,设计和合成OsBTF3基因序列的引物、扩增部分基因片段,构建RNAi基因沉默载体、通过农杆菌介导转化愈伤组织、植株再生、潮霉素抗性筛选和PCR验证、定量分析OsBTF3基因表达量,测定转基因水稻籽粒相关性状。结果表明,成功地获得了20个T1代OsBTF3-RNAi转基因株系,OsBTF3基因表达量得到显著的抑制和干扰,抑制效果平均达到85%;与野生型对照株相比,5个所测定RNAi转基因株系的穗长、穗粒数、千粒重和穗粒重等籽粒相关性状明显地减小或降低。因此,RNAi介导的基因沉默导致了OsBTF3基因表达水平抑制以及在籽粒性状中的功能缺失;OsBTF3可能是一个调控水稻籽粒相关性状重要的功能基因。     

结合三代测序与二代测序技术揭示蜜蜂球囊菌孢子转录组的复杂性

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在利用PacBio单分子实时(singlemoleculereal-time,SMRT)测序技术对蜜蜂球囊菌孢子(AaS)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)以及长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)进行鉴定和分析,进而揭示蜜蜂球囊菌孢子中转录组的复杂性。【方法】采用Suppa软件对蜜蜂球囊菌孢子中基因的AS事件进行鉴定。通过RT-PCR对不同类型的AS事件进行验证。采用TAPIS pipeline对蜜蜂球囊菌孢子基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析孢子全长转录本的poly(A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。联用CPC和CNCI软件和比对Swiss-prot数据库的方法预测lncRNA,取三者的交集作为高可信度的lncRNA集合。进一步比较lncRNA和mRNA的转录本长度,外显子数量与长度,内含子长度,GC含...     

长链非编码RNA在神经系统发育及神经性疾病中的作用

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度在200至数千个核苷酸序列,且不具有蛋白质编码潜能的非编码RNA。相较于研究较多的微小RNA（microRNA,miRNA）和干扰小RNA（small interfering,siRNA）等非编码小RNA,lncRNA的许多功能仍尚不清楚。但越来越多的研究发现,lncRNA可通过多种方式调控中枢神经系统发育,包括表观遗传组蛋白甲基化、转录辅因子调控、可变剪接调控等途经。而以上途经的异常均与多种人类重大疾病的发生密切相关,例如,阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）、自闭症（autism spectrum disorder,ASD）、精神分裂症（schizophrenia,SZ）等。本文就lncRNA在表观遗传水平、转录水平、转录后水平和翻译水平上调控神经系统发育以及其在人类神经性疾病中的作用进行综述。     

RNA干扰技术及其在细胞周期研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNA i)是由双链RNA(doub le-stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默(posttran-scridptional gene silenc ing,PTGS)。dsRNA经D icer酶降解成21-23nt的siRNA,并以其为模板,特定位点、特定间隔降解与之序列相应的mRNA。随着RNA i机制的深入研究与广泛应用,目前该技术已经普遍应用于细胞周期研究中,在阐明各种调控机制的同时也为基因治疗提供了新靶点。     

核糖体失活蛋白的结构功能与分布

核糖体失活蛋白是一类在植物中较广泛存在的毒蛋白。植物核糖体失活蛋白具有RNAN-糖苷酶活力,可作用于核糖体RNA,使核糖体失去蛋白质合成的功能。根据一级结构,核糖体失活蛋白可分为两种类型。Ⅰ型核糖体失活蛋白由一条链组成,分子量在25—30 kDa之间。Ⅱ型核糖体失活蛋白由两条以二硫键相连的链(A、B链)组成,分子量在60 kDa左右。B链可以与细胞表面含半乳糖的受体结合,有助于A链进入细胞,作用于核糖体。目前至少已从9个科31种植物中分离纯化了Ⅰ型RIP。Ⅱ型RIP较少,仅在6科8种植物中发现。除了具有RNA N-糖苷酶活性,还发现一些核糖体失活蛋白可以切割超螺旋双链DNA,产生缺口环状和线状DNA。此外,一种Ⅰ型RIP,克木毒蛋白还具有超氧化物歧化酶活性。     

siRNA干扰HIF-1α表达对高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞的影响

目的 研究胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)和缺氧诱导因子1a(hypoxia inducible factor 1a,HIF-1a)在高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞中的表达及其之间的关系;观察siRNA沉默HIF-1a基因对高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大的影响.方法 新生大鼠心肌细胞培养48h后,换用无血清DMEM培养液并分别加入高糖高胰岛素、高糖高胰岛素+HIF-1a-siRNA培养48h,未加入任何药物的心肌细胞在无血清DMEM培养液中继续培养48h作为对照.通过心肌细胞表面积、总蛋白含量指标检测心肌细胞肥大,并利用Real time PCR检测转染前后HIF-1a mRNA表达变化及免疫细胞化学方法检测HIF-1a及IRS1蛋白水平的表达.结果 高糖高胰岛素可增加心肌细胞表面积、总蛋白含量、HIF-1a mRNA以及HIF-1a表达,并降低IRS1表达.转染siRNA后使HIF-1a基因的表达下降,能部分抑制心肌细胞的肥大,降低心肌细胞表面积和总蛋白含量,但对IRS1表达的影响不明显.在对正常对照组和高糖高胰岛素组中IRS1表达量与HIF-1a表达量进行相关分析表明,两者的表达量成负相关.结论 通过siRNA技术对HIF-1a的有效沉默可明显地抑制高糖高胰岛素诱导大鼠乳鼠心肌细胞肥大,并且这种作用可能是通过作用于IRS1/PI3K/ Akt/MTOR途径来实现的.     

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.     

RNAi技术在蜂学研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性引起基因表达沉默的现象,特异性和高效性是RNAi技术的特点。本文主要从调控目标基因的表达、级型分化的分子基础、防治蜜蜂病毒病3个方面概述了RNAi技术在蜂学研究中的应用进展情况,并展望RNAi技术在蜜蜂功能基因组研究领域的应用前景。     

tRNA来源的小片段RNA——新的基因表达调控因子

转移核糖核酸(tRNA)是蛋白质合成的关键接头分子,特异性识别信使RNA(mRNA)的密码子信息,将其接载的氨基酸基团掺入到新生多肽链中。最新研究表明,在很多物种中,在某些特定情况下,tRNA或其前体被特异性剪切产生tRNA来源的小片段RNA(tRNA-derived fragment,tRF)。这类tRF是一类新的基因表达调控因子,其发挥作用的机制多样,如某些tRF以microRNA方式抑制mRNA翻译;某些tRF作为逆转录病毒RNA基因组的逆转录引物;而某些tRF参与了前体rRNA剪切复合物的组装。此外,细胞受胁迫产生的带有多聚鸟苷酸模块的tRF则会竞争性抑制延伸因子elF4G与mRNA的结合,从而抑制蛋白质翻译。随着研究的继续深入,对tRF的发生发展、作用机制以及在疾病中的潜在作用将会进一步丰富。拟从tRF作为新的基因表达调控分子的角度,简要介绍tRF发挥作用的分子机制。     

RNA干扰技术在植物线虫基因功能研究及虫害防治方面的应用

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是双链RNA（double—stranded RNA,dsRNA）介导的同源mRNA特异降解的过程,具有高效性、非绝对特异性和表型可遗传性。其在遗传育种、基因功能研究、药物研发等各方面具有广泛的运用前景。近年已应用到植物线虫基因功能的研究中。随着对植物线虫基因组及基因功能研究的不断深入。RNAi技术在植物线虫防治方面的研究也取得了很大进展。