Affinity maturation of a computationally designed binding protein affords a functional but disordered polypeptide

Computational methods have been recently applied to the design of protein–protein interfaces. Using this approach, a 61 amino acid long protein called Spider Roll was engineered to recognize the kinase domain of the human p21-activated kinase 1 (PAK1) with good specificity but modest affinity (K_D = 100 μM). Here we show that this artificial protein can be optimized by yeast surface display and fluorescence-activated cell sorting. After three rounds of mutagenesis and screening, a diverse set of tighter binding variants was obtained. A representative binder, MSR7, has a >10²-fold higher affinity for PAK1 when displayed on yeast and a 6 to 11-fold advantage when produced free in solution. In contrast to the starting Spider Roll protein, however, MSR7 unexpectedly exhibits characteristics typical of partially disordered proteins, including lower α-helical content, non-cooperative thermal denaturation, and NMR data showing peak broadening and poor signal dispersion. Although conformational disorder is increasingly recognized as an important property of proteins involved in cellular signaling and regulation, it is poorly modeled by current computational methods. Explicit consideration of structural flexibility may improve future protein designs and provide deeper insight into molecular events at protein–protein interfaces.     

Directed evolution of barnase stability using proteolytic selection

We report the construction of a phage-displayed repertoire of mutants of the ribonuclease barnase from Bacillus amyloliquefaciens. The construction was guided by the natural variability between two closely related ribonucleases, barnase and binase from Bacillus intermedius. This repertoire was selected using a proteolytic selection method, allowing sorting of the library according to the resistance of the mutants toward proteolysis. Susceptibility toward proteolysis has been correlated with flexibility and unfolding, and is thus expected to yield mutants with increased thermal stability.Enrichment of barnase mutants with specific combinations of amino acid residues at four of the randomised positions was observed. Three of these enriched amino acid residues are present in neither barnase nor binase. For some of the mutations, the improvement in proteolytic stability does not lead to a pronounced improvement in thermodynamic stability, indicating that the factors governing the proteolytic stability in some cases may be different from those governing the thermodynamic stability, e.g. propensity to local unfolding.The results obtained add important knowledge to a novel use of phage display technology for selection of thermodynamically stable proteins. Only by carefully establishing the parameters that can be adjusted, and recognising the influence this will have on the outcome of selection, will it be possible to realise the powerful technique of proteolytic selection.     

菟丝子三种提取工艺对心血管活性的影响

目的 观察菟丝子不同提取工艺对实验犬血流动力学药效学的影响。方法 16只成年杂种犬随机分成四组,给药组剂量为20mg／kg静脉注射。结果 经初步筛选实验结果表明,三个不同提取工艺样品均能增加心肌冠脉血流量,但3个样品对心肌耗氧量具有不同的影响,其中3号制剂心肌耗氧量降低;而1、2号制剂则增加心肌耗氧量。结论 3个样品各有特点,综合效应3号最佳。     

绍鸭卵巢卵泡发育相关新EST的分离与表达

采用银染mRNA差异显示方法从绍鸭卵巢等级卵泡中分离并筛选到 3个差异表达序列标签 (ExpressedSequenceTags ,ESTs)SXDF0 2 0 1(2 71bp)、SXDF0 2 0 2 (2 0 0bp)和SXDF0 2 0 3(173bp) ,通过测序和BLAST检索 ,发现SXDF0 2 0 1与GenBank中登录的所有物种的所有序列均无同源性 ,是在绍鸭卵巢卵泡发现的新EST ,现已登录GenBank(GenBank登录号 :CB0 72 6 2 9) ,而SXDF0 2 0 2和SXDF0 2 0 3则分别与GenBank公布的鸡的EST和肌胃肌球蛋白重链高度同源。用 5′ RACE将SXDF0 2 0 1延伸至 5 4 4bp ,经过BLAST再次检索 ,仍然未发现中度同源序列采用相对定量RT PCR方法进一步研究SXDF0 2 0 1和SXDF0 2 0 2在绍鸭组织中的时空特异性表达 ,发现这两个EST在产蛋高峰期绍兴鸭的下丘脑、垂体、肌肉、肝脏、脂肪等组织都有表达 ;SXDF0 2 0 1在 30日龄卵巢的表达水平显著高于 6 0 (P <0 0 5 )和 90 (P =0 0 15 )日龄 ;而SXDF0 2 0 2在卵巢发育的不同阶段的表达水平没有变化 ;SXDF0 2 0 1在卵巢卵泡颗粒层中的表达总体高于膜层 ,SXDF0 2 0 2在颗粒层中的表达F3 >F5>Fw(P <0 0 1) ,而在F1卵泡降至最低 (P <0 0 1) ,膜层中以Fw 卵泡表达水平最高 (P <0 0 1)。     

黄热病病毒检测微阵列的研究制备

目的:制备黄热病病毒寡核苷酸检测微阵列.方法:根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出寡核苷酸探针用于制备基因芯片,克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因DNA经限制性显示技术扩增并标记,完成杂交后对芯片进行扫描和数据分析.结论:微阵列检测技术为检测黄热病病毒提供了一种早期、快速、可靠的方法,具有应用于临床检测的前景.     

大麻素抑制大鼠三叉神经节神经元ATP激活电流

本文在培养的大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)神经元上采用全细胞膜片钳技术,探讨大麻素对大鼠TG神经元ATP激活电流(ATP-activated currents,IATP)的影响.结果显示(1)胞外给予ATP,大部分受检细胞(67/75,89.33%)可记录到一个内向电流,且具有剂量依赖性.该电流可被P2X嘌呤受体特异性拮抗剂PPADS所阻断.(2)预加WIN55212-2[大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,CB1受体)激动剂]可对IATP产生抑制作用,此作用呈剂量依赖性,并可被CB1受体特异性拮抗剂AM281阻断.预加不同浓度的WIN55212-2(1x10-13、1x10-12、1x10-11、1x10-10、1x10-9和1x10-8mol/L)对IATP(1x10-4mol/L ATP)的抑制作用分别为(8.14±3.14)%、(20.11±2.72)%、(46.62±3.51)%、(72.16±5.64)%、(80.21±2.80)%和(80.59±3.55)%.(3)预加WIN55212-2后IATP的浓度-反应曲线明显下移;最大反应浓度时的IATP幅值减小了(58.02±4.21)%,而阈值基本不变;预加WIN55212.2前后曲线的EC50值非常接近(1.15x10-4mol/L vs 1.27x10-4 mol/L).(4)预加forskolin[腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)激动剂]或8-Br-cAMP可以逆转WIN55212-2对IATP的抑制作用.以上结果表明,大麻素可能作用于CB1受体,通过抑制AC-cAMP-PKA途径发挥对IATP的抑制作用.     

两种标记方法对60mer寡核苷酸芯片背景信号影响的初步分析

研究两种不同的样本标记方法对人全基因组高密度60mer寡核苷酸芯片背景信号的影响。收集5对患病与健康人外周血单个核细胞,分别提取总RNA后,采用限制性显示技术（restriction display,RD）进行样本双色（Cy3/Cy5）荧光标记,与5张Agilent 60mer高密度（22K）Human 1B寡核苷酸芯片进行杂交。芯片全部杂交点分3组：基因探针组、阳性对照组和阴性对照组。阳性对照采用荧光标记寡核苷酸直接掺入法进行标记。对全部杂交信号点的Cy3和Cy5背景信号值,用SPSS软件进行数据转换、正态性检验、方差齐性检验、变异系数分析和重复数据的方差分析。数据分析结果显示,Cy3 标记的背景信号值均高于 Cy5标记的背景信号值。重复测量数据的方差分析表明,在Cy3 和Cy5标记中,两种不同标记方法间的背景信号值的差异极显著（PCy3＜0.01, PCy5＜0.01）,且RD标记点的背景信号平均值低于荧光标记寡核苷酸直接掺入标记法标记的阳性对照点。RD标记方法是一种有用的低背景信号的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。     

血清学检测H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆的分析

目的 为分析H-Y噬菌体Fab抗体特异性,筛选用于抗体亲和力提高的H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆.方法 以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有雄性特异性结合活性的阳性克隆A6、A8、E6为基础,通过C57BL/6鼠脾细胞为抗原的ELISA分析3株阳性克隆的特异性,镜下观察亲和力较好的A8阳性克隆ELISA结果,利用生物信息学方法预测分析该克隆的抗体基因可变区序列和结构.结果 ELISA分析显示3株阳性克隆具有雄性特异性,其中A8阳性克隆具备较好的雄性特异性.A8克隆具有免疫球蛋白轻链和重链可变区结构,其重链、轻链可变区分别属于VHI和VκIV基因家族.结论 A8阳性克隆可用于后续的导向筛选和抗体基因改造等研究工作.     

同位素示踪技术在丛枝菌根真菌生态学研究中的应用

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌是生态系统中重要的土壤微生物之一。AM真菌菌丝体网络是由AM真菌菌丝体在土壤生态系统中连接两株或两株以上植物根系所形成的菌丝体网络。随着菌根学研究的深入,如何直观的揭示AM真菌的生态学功能已经成为相关领域关注的热点问题。研究发现,利用同位素示踪技术可以开展AM真菌与宿主植物对土壤矿质营养的吸收、转运等方面的研究,以及菌丝体网络对不同宿主植物之间营养物质的分配研究和AM真菌在生态系统生态学中的功能研究。基于此,为了阐明同位素示踪技术在AM真菌研究中的价值,围绕菌根学最新研究进展,系统回顾了利用同位素示踪技术探究AM共生体对不同元素吸收和转运的机制、同位素示踪技术在AM真菌菌丝体网络研究中的价值和利用同位素示踪技术研究AM真菌在生态系统中的功能,为AM真菌生态学功能的研究提供理论基础,并对本领域未来的研究方向和应用前景进行展望。