蜱传脑炎病毒衣壳蛋白的可溶性表达、纯化及初步应用

目的 构建蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)衣壳蛋白(capsid protein, C)原核表达质粒,并以其表达、纯化的C蛋白作为抗原检测临床血清,评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis, TBE)临床血清学诊断中的应用。方法 登录Genbank对TBEV“森张”株C蛋白基因序列设计扩增引物,以PCR扩增C蛋白目的基因并克隆至原核表达载体pET-32a(+)后,构建重组表达质粒pET-32a-C。再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导剂诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以制备的C蛋白作为包被抗原,用间接ELISA分别检测20份TBEV IgG抗体阳性临床血清、10份流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)阳性临床血清及20份阴性血清,并计算检测的特异性和敏感度。结果 重组表达质粒pET-32a-C序列测定正确;经12%SDS-PAGE电泳分析,重组C蛋白主要为可溶性蛋白表达;纯化...     

核糖体蛋白的核糖体外功能及其在疾病中的作用

糖体蛋白(ribosomal protein,RP)是核糖体的重要组分之一,在生物体内行使蛋白质合成的功能.最近的研究表明,RP除了参与蛋白质合成外,还在细胞增殖、分化、凋亡、DNA修复等细胞过程中发挥作用.RP在进化过程中高度保守,因此当RP基因表达异常时,机体必会产生相应的异常反应.RP的功能障碍与发育、代谢、和癌...     

羊驼皮肤cDNA文库构建及鉴定

采用原核表达载体pet-32-a 构建了羊驼皮肤组织cDNA文库。双链cDNA采用Universal Ribo Clonec DNA Synthesis System合成,并经过琼脂糖分级胶回收,去除了小于400 bp的片断;通过酶切载体的去磷酸化和插入片断的磷酸化,提高了重组率,蓝白斑筛选结果全部为阳性;库扩增后检测容量达2.25×107。随机挑取阳性克隆进行单引物测序分析,七个测序样品中获得两个与毛发生长相关的EST(expression sequence tag),分别为S100钙离子结合蛋白A3基因(S100 calcium binding protein A3,S100A3)的部分序列和高硫角蛋白关联蛋白基因(high sulfur keratin-associated protein,KRTAP3-3)的部分序列,说明所构建的文库具有较高的代表性。     

湖南汉族人群IL-1O启动子和IL-1ra基因多态性与SLE相关性研究

目的:研究湖南汉族人群IL-10启动子和IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)的基因多态性,探讨IL-10启动子和IL-1ra基因多态性与SLE疾病的关系。方法:PCR和限制性内切酶酶切分析SLE患者(n=83)和正常对照人群(n=125)IL-10启动子和IL-1ra基因多态性,对基因频率进行分析。结果:湖南汉族人群IL-1ra及IL-10启动子基因具有多态性;SLE患者IL-1RN*1等位基因的频率显著高于正常对照组(P<0.05,RR=5);SLE患者IL-10启动子区-597位*A、-824位*T和ACC亚型的基因频率高于正常对照组(P<0.001)。结论:SLE患者IL-1RN*1的基因频率、IL-10启动子区-597位和-824位的基因多态性与正常人比较有显著差异,提示以上基因可能与SLE的发病有一定相关性。     

大鼠PIAS3蛋白表达、纯化及生物信息学分析

[目的]构建大鼠His-PIAS3真核表达载体,将His-PIAS3于体外进行表达纯化,并对PIAS3进行生物信息学分析。[方法]采用分子克隆构建His-PIAS3-pcDNA3.1真核表达载体,之后转染入HEK293细胞进行表达,考马斯亮蓝染色检测整体蛋白变化,免疫印迹鉴定His-PIAS3蛋白表达及细胞整体蛋白SUMO化,镍柱纯化His-PIAS3蛋白。生物信息学方法分析大鼠PIAS3蛋白的理化性质、亲疏水性、二级结构及序列的保守性。[结果] His-PIAS3目的基因扩增成功,且亚克隆入pcDNA3.1载体;和空载体组相比,转染His-PIAS3-pcDNA3.1组PIAS3蛋白表达水平明显增加,且整体蛋白的SUMO化水平显著升高;镍柱纯化可获得较高纯度的His-PIAS3蛋白。生物信息学结果显示,大鼠PIAS3蛋白包含628个氨基酸残基,分子量为68.3 kDa,理论等电点为8.05,亲水性平均值为-0.242;PIAS3主要定位于膜内;PIAS3蛋白的二级结构主要由18.79%α-螺旋、13.69%延伸链和67.52%无规卷曲组成;不同物种间pias3序列相似性均在70%以上...     

Hsa-miR-212靶向调控BRCA1对乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗敏感性的影响

[目的]探讨Hsa-miR-212靶向调控BRCA1对乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗敏感性的影响。[方法]设MDA-MB-231细胞组、RT组(X射线以12Gy/min的剂量率发射,照射孵育时间为48h)、Hsa-miR-212 mimics组、RT+Hsa-miR-212 mimics组,各组设6个平行样,培养72 h。试验结束后,采用细胞计数试剂盒-8和结晶紫测定增殖及单克隆形成数目,流式细胞仪测量细胞凋亡水平,RT-PCR法及蛋白印迹法测定Hsa-miR-212、BRCA1 mRNA和蛋白水平。[结果]与MDA-MB-231细胞组比较,RT组、RT+Hsa-miR-212 mimics组OD值、存活率、细胞克隆形成数目、Hsa-miR-212 mRNA、BRCA1 mRNA与蛋白、穿膜数均降低(P<0.05),Hsa-miR-212 mimics组OD值、存活率、细胞克隆形成数目、Hsa-miR-212 mRNA、BRCA1 mRNA与蛋白、穿膜数升高(P<0.05);与RT组比较,Hsa-miR-212 mimics组、RT+Hsa-miR-212 mimics...     

miR-23a对软骨细胞增殖、分化和氧化应激的影响机制

[目的]探究miR-23a调控AMPK/SIRT1通路对人退变关节软骨细胞增殖、分化和氧化应激的影响。[方法]人退变关节软骨分为对照组、miR-23a mimic组、miR-23a inhibitor组。通过对以上三组细胞转染miR-23a NC、miR-23a mimic和miR-23a inhibitor转染来干扰细胞中miR-23a的表达水平。转染完成后,分别通过CCK-8、 ELISA和Western Blot实验检测各组细胞增殖、氧化应激水平、分化能力以及AMPK/SIRT1信号通路的表达水平。[结果]三组细胞的各项比较差异显著(P<0.05)。与对照组相比,miR-23a mimic组的miR-23a、骨形成蛋白(BMP)2、BMP4、MDA水平显著升高(P<0.05),而OD值、SOD、AMPK/SIRT1通路水平显著降低(P<0.05)。与对照组相比,miR-23a inhibitor组的miR-23a、BMP2、BMP4、MDA水平显著降低(P<0.05),而OD值、SOD、AMPK/SIRT1通路水平显著升高(P<0.05)。[结论] ...     

THAP8基因可被HIF-1a上调并促进肺癌细胞活力、克隆形成和侵袭

死亡相关蛋白(Thanatos-associated proteins,THAP)家族的许多成员已被证实与细胞增殖、凋亡和癌症密切相关,而THAP8的功能尚不清楚.为了探究THAP8在癌症中的表达,对TCGA和Oncomine数据库进行了分析,发现THAP8 mRNA在肺癌组织的表达显著高于癌旁正常组织;接着采用荧光定...     

Prediction of GPCR-G protein coupling specificity using features of sequences and biological functions

Understanding the coupling specificity between G protein-coupled receptors （GPCRs） and specific classes of G proteins is important for further elucidation of receptor functions within a cell. Increasing information on GPCR sequences and the G protein family would facilitate prediction of the coupling properties of GPCRs. In this study, we describe a novel approach for predicting the coupling specificity between GPCRs and G proteins. This method uses not only GPCR sequences but also the functional knowledge generated by natural language processing, and can achieve 92.2% prediction accuracy by using the C4.5 algorithm. Furthermore, rules related to GPCR-G protein coupling are generated. The combination of sequence analysis and text mining improves the prediction accuracy for GPCR-G protein coupling specificity, and also provides clues for understanding GPCR signaling.     

大负荷运动诱导大鼠骨骼肌细胞凋亡的作用及线粒体凋亡机制

目的:以丝氨酸蛋白酶Omi为切入点,探究大负荷运动诱导大鼠骨骼肌细胞凋亡的可能机制。方法:126只健康雄性SD大鼠随机分为安静对照组(C),离心运动组(E),单纯阻断组(U),二甲基亚砜(DMSO)组(D),运动阻断组(EU)。除C组外,其余4组随机分为干预后0 h组、12 h组、24 h组、48 h组、72 h组,每组6只。E组与EU组大鼠在跑台上进行坡度为-16°,速度为16 m/min, 90 min的一次性大负荷运动。U组、D组与EU组进行一次性药物干预,给予U组和EU组大鼠腹腔注射1.5μmoL/kg Omi特异性抑制剂Ucf-101,同样给予D组大鼠腹腔注射1.5μmoL/kg的0.5%DMSO,于实验后不同时间点分批取比目鱼肌,检测其Caspase-3,-8,-9,-12的活性以及Omi和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达。结果:与C组相比,E组骨骼肌线粒体形态结构发生典型的病理改变,骨骼肌线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放程度明显增加(P<0.01)或(P<0.05),同时骨骼肌Omi、XIAP蛋白表达均明显增加(P<0.01或P<0...