酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达

最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ (BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生．为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro¹⁶⁴⁰～Ser¹⁶⁹⁰的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响．用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接．结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26) μg/L和(1.31±0.15) U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12) μg/L和(0.79±0.09) U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用．而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7) μg/L和(0.28±0.08) U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接．另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接．为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据．     

褪黑素对海人酸致痫大鼠海马内TGF-β3水平的影响

目的探讨褪黑素(me1atonin,MT)对海人酸(kainic acid,KA)致痫大鼠海马内TGF-β3的影响,进一步明确其在中枢内的作用。方法将实验大鼠随机分为3组:生理盐水对照组(NS组)、海人酸组(KA组)、褪黑素+海人酸组(MT+KA组)。各组大鼠给予相应试剂处理后观察并记录大鼠行为学改变,用免疫组织化学方法、RT-PCR检测大鼠海马内TGF-β3(transforming growth factor-β3)的表达情况及其mRNA变化。结果动物行为学观察显示,NS组无癫痫发作,KA组发作程度为Ⅲ-V级,MT+KA组为0-Ⅲ级;免疫组织化学结果显示,TGF-β3在3组大鼠海马内均有表达,其中KA组、MT+KA组较NS组表达增强,MT+KA组较KA组增强,差异具有显著性意义(P0.05);RT-PCR结果显示,与NS组相比较,KA组、MT+KA组大鼠海马内TGF-β3 mRNA含量均升高;但MT+KA组升高较KA组多,差异具有显著性意义(P0.05)。结论褪黑素能明显改善海人酸诱发的大鼠癫痫,增强海马内TGF-β3的表达,减轻海马神经元损伤,发挥中枢保护作用。     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

HCV全长NS3基因表达及在抗体检测中的应用

丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)是引起非甲非乙型肝炎的主要病原因子。被ＨＣＶ感染的病例中 ,超过 5 0 %以上会引起持续性感染、慢性肝炎 ,最终可能引起肝硬化和肝细胞癌[1] 。ＨＣＶ严重威胁人类健康 ,但目前对丙肝患者尚缺乏有效的治疗手段 ,因此 ,严格把好血源关 ,提高对丙肝患者检出的灵敏度 ,是阻止丙肝血源传播的有效手段。丙型肝炎病毒基因组为单股正链ＲＮＡ ,核苷酸长约 9.5ｋｂ ,仅含一个开放阅读框 ,翻译成一个大的聚蛋白前体 ,由宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶加工成多个成熟蛋白。其中非结构蛋白ＮＳ3分子量为 70ｋＤ ,有丝氨酸蛋白酶…     

肿瘤血清标志物在乳腺癌诊断中的意义

目的:探讨血清标志物CEA、CA15-3、CA12-5、TPS和VEGF不同组合在乳腺癌诊断中的临床应用价值.方法:用ELISA法分别检测53例乳腺癌患者、50例乳腺良性肿瘤及50例正常女性血清CEA、CA15-3、CA12-5、TPS和VEGF水平.结果:乳腺癌患者血清5种标志物的水平均较良性疾病组及正常对照组高,差异有统计学意义.CEA、CA15-3、CA12-5、TPS和VEGF对乳腺癌诊断的阳性率分别为30.2%、26.4%、37.75%、56.6%、35.8%,各种组合检测中,TPS与CA15-3联合检测阳性率可达到71.7%.结论:血清标志物中TPS与CA15-3联合检测是筛查乳腺癌的较好的组合,可以互相弥补单一指标的不足,以互补的方式较为显著地提高乳腺癌的检出率.     

O139型霍乱菌苗生产用菌株93—3稳定性研究

Ｏ１３９型霍乱菌苗生产用菌株９３－３经过３０代连续传代,与原代菌株作比较,结果表明：该菌传代前后表型生物学特征（生长特性,生化反应,特异性血清学反应,耐药性等）,及遗传学特征（Ｇ＋Ｃｍｏｌ％测定）均未发现明显差异,证明该菌株具有较好的稳定性。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。方法用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常中国恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL。1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上。结论此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型。     

1,25二羟基维生素D_3对兔角膜碱烧伤朗格罕氏细胞影响

目的：研究1,25二羟基维生素D3（骨化三醇）对兔角膜碱烧伤后角膜朗格罕氏细胞分布的影响,并初步探讨其作用机制。方法：在兔角膜制作碱烧伤模型,然后实验组局部和全身给予1,25二羟基维生素D3,分别在第3,7,21天时对正常组,实验组和对照组家兔行角膜共聚焦显微镜,HE染色观察角膜病理改变。结果：正常组角膜中央在三个时间点均未检测出朗格罕氏细胞。实验组和对照组碱烧伤后3、7天角膜中央出现朗格罕氏细胞,对照组密度高于实验组（p〈0.05）;碱烧伤后21天两组朗格罕氏细胞密度相近（p〉0.05）。实验组炎性反应程度在第7,21天时轻于对照组。结论：1,25二羟基维生素D3能够在兔角膜碱烧伤早期抑制朗格罕氏细胞的向心性迁移,并且能在一定程度上抑制炎性反应。     

HeLa细胞中Skp2的表达调控p21WAFCIP1稳定性

泛素 蛋白酶体抑制剂MG 132处理的HeLa和SaoS 2细胞中 ,低表达的p2 1WAF CIP1受泛素 蛋白酶体通路调控 .为探讨肿瘤细胞中高表达的E3连接酶底物结合亚基 Skp2和低表达的p2 1WAF CIP1之间的关系 ,在HeLa细胞中转染Skp2的反义寡核苷酸后 ,p2 1表达水平明显升高 .同时 ,相对于转染空载体和Skp2ΔF(Skp2的F box缺失突变体 )的真核表达载体 ,转染全长Skp2的HeLa细胞中 ,p2 1表达水平显著下降 ,说明肿瘤细胞中Skp2调节p2 1的稳定性 ,并且这种调控作用依赖于Skp2蛋白中的F box结构 .免疫荧光结果表明 ,Skp2和p2 1共定位于细胞核 ,这为两者间的相互作用提供了前提 ;体内相互免疫共沉淀结果表明 ,p2 1和其它SCFSkp2 的底物一样与Skp2直接结合 ,并且它们之间的结合区不在F box结构域 ,这一结果在体外的GST pulldown实验中得到验证     

强直性脊柱炎滑膜组织破骨细胞表型、TNF-α及MMP-3的表达及对软骨破坏作用的研究

目的检测破骨细胞表型、基质金属蛋白酶-3及肿瘤坏死因子-α在强直性脊柱炎患者滑膜组织的表达,滑膜单核巨噬细胞与软骨共培养,了解其在强直性脊柱炎软骨破坏中的作用,探讨强直性脊柱炎软骨破坏机制。方法采用酶组织化学技术检测滑膜组织内破骨细胞表型表达,原位杂交技术检测强直性脊柱炎患者滑膜组织内肿瘤坏死因子-α、基质金属蛋白酶-3的表达,Leica Qwin高清晰图像分析系统测定阳性细胞数,强直性脊柱炎滑膜单核巨噬细胞培养并与正常软骨共培养,HE染色及扫描电镜观察软骨的破坏程度。结果破骨表型细胞在滑膜组织内阳性表达,阳性细胞计数与对照组有显著差异（P〈0．01）;肿瘤坏死因子-α、基质金属蛋白酶-3在强直性脊柱炎患者滑膜细胞内有棕黄色颗粒沉着,阳性细胞计数与对照组有显著差异（P〈0．01）;滑膜细胞与正常软骨共培养,HE染色见软骨表面粗糙,有小凹陷,扫描电镜可见软骨表面不定形物质成斑片状,胶原纤维暴露,有断裂,抗肿瘤坏死因子-α可以减轻软骨的破坏程度。结论破骨表型细胞、肿瘤坏死因子-α及基质金属蛋白酶-3是软骨破坏的重要因素,破骨表型细胞通过表达基质金属蛋白酶-3分解软骨基质,进而发挥软骨的破坏作用,抗肿瘤坏死因子-α可以抑制破骨表型细胞对软骨的破坏。