蓝藻正反义pepcA基因导入对大肠杆菌中脂类合成的调控

为了探索原核生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在调控脂类代谢中的作用。PCR法扩增了鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120 PEPC基因中含保守结构域Fa 的一段基因片段pepcA,并将其克隆到pMD 18-T载体上。将pepcA正反向连接到穿梭表达载体pRL-489上BamHI位点之间,构建得带有pepcA正反义基因的载体pRL-Sen pepcA和pRL-Anti pepcA,转化入大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a宿主细胞中。分析结果表明：pepcA片段的转入对宿主菌的生长影响不大;与野生型细胞相比较,转反义pepcA片段E.coli中PEPC酶活性降低到野生菌的30.2%,蛋白合成减少23.6%,脂类的合成增加了46.9%,;而转正义pepcA片段E.coli PEPC酶活性是野生菌的2.38倍,蛋白合成增加了14.5%,脂类合成减少了49.6%;转基因菌中十八碳酸的含量明显增加。上述结果可能为利用原核生物做生物柴油原料提供线索。     

转PEPC基因水稻具有初级CO2浓缩机制的生理特点

以原种粳稻Kitaake为对照, 研究了转玉米PEPC基因水稻的PEPC的高表达和碳同化特性的关系. 结果显示: 与原种相比, 转PEPC基因水稻气孔导度和光合速率显著增加, 经统计分析, 气孔导度的增加与光合速率的增加并无相关性. 而在高光强下, 与CO2浓缩有关的PEPC, CA酶蛋白的表达显著增加. 因此在大气CO2浓度下可显著增加光合能力(50%); 无CO2条件下, 可减少叶内CO2释放量, 从而降低了CO2补偿点. 用专一的抑制剂DCDP处理, 证明转PEPC基因水稻叶内PEPC的高表达与碳同化能力的提高和Fv/Fm的稳定性有关. 用14C示踪20 s, 转PEPC基因水稻14C较多的分配在C4光合原初产物天冬氨酸中, 意味着叶内存在着一定的C4光合代谢途径. 上述结果说明, 用代谢工程可以在叶内构建初级的CO2浓缩机制, 为转基因的高光效育种技术提供了生理依据.     

双磷酸核酮糖羧化酶和果糖双磷酸酯酶合成的光调节

用红光(650nm)或远红光(740nm)照射后,测定了黄化芥菜子叶中活化状态下核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(RuBPCase,E.C.4.1.1,39),果糖1,6-二磷酸酯酶(FBPase,E.C.3.1.3.11)和景天庚酮糖1,6-二磷酸酯酶(SBPase,E.C.3,1.3.37)的酶活性。叶片对光的反应表明存在光敏感期。在光敏感期的红光可使 RuBPCase 和 FBPase 合成,但对 SBPase 的合成没有影响。红光的这种作用可被远红光逆转,所以红光对这两种酶的合成的启动是通过光敏色素而实现的。在超过阈值的光下,酶合成的量与光量子数无关,光敏色素只影响酶合成的启动,但是酶的持续合成还要依赖其它因素。     

烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶四级结构的研究(英文)

本文提出三种证据证明烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基伸展在小亚基的外面,小亚基排列在大亚基中间的概念。证据是:1.固定化胰蛋白酶在一定条件下可水解RubisCO的大亚基但不水解小亚基,而天然胰蛋白酶水解大亚基,也水解小亚基。2.固定化抗小亚基IgG-Sepharose可与游离的小亚基相结合,但不能与全酶结合。3.低浓度尿素处理可使固定化的RubisCO-Sepharose上的小亚基解离下来,而大亚基仍结合在载体上,这说明RubisCO是通过定位在分子表面上的大亚基的ε-氨基与Sepharose共价偶联的。当RubisCO中的小亚基全部被解离后,大亚基之间的结合进一步增强,这时解离大亚基所需的尿素浓度要比小亚基存在时高。任何RubisCO的四级结构模型都应将小亚基置于大亚基中间受保护的位置,一部份小亚基可暴露于全酶分子表面。     

适于蛋白双向电泳的水稻叶片样品提取方法初探

在水稻基因组测序完成后,利用蛋白质组学技术揭示水稻基因功能的研究,已成为水稻分子生物学研究的热点之一。水稻叶片作为DNA研究的便利材料被经常使用,但对蛋白质研究来说,占叶片全蛋白50%～60%的核酮糖二磷酸羧化酶（RuBP羧化酶）对低丰度蛋白常常造成掩盖。以水稻叶片为材料,用不同浓度的聚乙二醇（PEG）去除叶片中RuBP羧化酶。通过SDS-PAGE垂直电泳比较发现,浓度为17%的PEG对去除RuBP羧化酶效果最好,所获得的蛋白质样品可以得到质量较高的双向电泳图谱。     

异子蓬PEPC基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析

该研究在Escherichia coli Transetta（DE3）中表达了C₄盐生植物异子蓬的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）,并进行了酶学特性及非生物胁迫响应分析,以期初步阐明PEPC基因在非生物胁迫下的生物学功能,为异子蓬PEPC的非生物胁迫的抗性生理研究提供参考依据。基于5′-RACE技术获得异子蓬PEPC全长基因（GenBank登录号为KP985714）,构建了E.coli Transetta::pGEX-4T-1-PEPC重组菌株。通过分光光度法和酶联免疫吸附技术（ELISA）分别测定了PEPC重组蛋白的酶活和含量,并检测E.coli Transetta::pGEX-4T-1-PEPC重组菌株在非生物胁迫下的耐受性。生物信息学分析发现,该PEPC基因的cDNA全长为2 901 bp,编码966个氨基酸,与甜菜（Beta vulgaris）PEPC的氨基酸序列一致性达90%,具有PEPC的典型保守结构域（PEPcase）以及VlTAHPTQsiRR和VMIGYSDSgKDAG活性位点;PEPC蛋白属PEPC-1型的不含信号肽的非分泌型亲水蛋白。Western blot结果显示,融合GST的PEPC蛋白的分子量约130~140 kD;在37 ℃用0.8 mmol/L IPTG诱导E.coli Transetta::pGEX-4T-1-PEPC重组菌株显示出更高的PEPC酶活及含量,而且E.coli Transetta::pGEX-4T-1-PEPC重组菌在200~800 mmol/L NaCl、5%~20% 聚乙二醇（PEG） 6 000、25 ℃~52 ℃温度范围、50~400 μmol/L甲基紫精和pH 3.0~11.0的非生物胁迫下生长均明显优于对照。研究表明,异子蓬PEPC基因的表达提高了E.coli耐受非生物胁迫的能力。     

外源Ca2+对PEG处理下转C4型PEPC基因水稻光合生理的调节

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)通过固定二氧化碳参与光合作用, 是关键的C₄植物光合作用酶。为了揭示高光效转C₄ PEPC基因水稻(Oryza sativa)对干旱胁迫的适应机理, 以高表达转C₄ PEPC水稻(PC)和野生型水稻Kitaake (WT)为供试材料, 在植株的4-5叶期, 使用不同浓度外源CaCl₂溶液处理, 测定在15%聚乙二醇6000 (polyethylene glycol-6000, PEG-6000)胁迫下叶片相对含水量、光合参数、内源钙总含量、叶片总蛋白激酶活性、PEPC酶活性以及相关基因表达和蛋白质含量。结果表明, 0.5 mmol∙L^-1 CaCl₂明显提高PC叶片相对含水量(P<0.05), 2 mmol∙L^-1和10 mmol∙L^-1 CaCl₂则作用不显著, 对WT则影响不显著。不同浓度钙处理对PEG处理PC的净光合速率影响不显著, 而通过维持气孔导度减少水分胁迫。内源总钙浓度的数据显示, 在PEG6000处理下, PC具有维持稳定内源Ca²⁺浓度的能力, 过高浓度(10 mmol∙L^-1 CaCl₂)钙处理反而降低了PEPC酶活性、PEPC基因表达和可溶性蛋白的含量。     

盐分胁迫对大叶藻某些胞内酶耐盐性及其生理功能的影响

分别以3个盐度（100％、150％和200％人工海水）处理大叶藻（Zostera marina L.)植株5d,然后在体外测定了大叶藻叶片中两个胞内酶（PEP羧化酶和苹果酸脱氢酶）的耐盐性和在不同盐度介质中（100％、150％、200％、300％人工海水）经不同盐度（100％、150％和200％人工海水）海水预处理的大叶藻叶片光合速率以及一些生理指标的改变。结果表明在高于海水的盐度下,大叶藻叶片中丙二醛（MDA）、还原性糖和Na^ ,Cl^-含量及渗透势（绝对值）均随海水盐度的提高而增加,但K^ 和游离氨基酸的含量均降低。从处理5d的植株中提取的苹果酸脱氢酶在体外每一盐度下,其活性（A）大小依次为：A100％ASW＞A150％ASW＞A200％ASW（artificial seawater),并且其活性对盐度敏感（低盐度激活高盐度抑制）;但从100％及200％人工海水（ASW）处理的植株中提取的PEP羧化酶的活性在体外对盐度不敏感,而从150％人工海水处理的植株中提取的PEP羧化酶的活性对盐度具有很高的抗性。实验结果显示由150％人工海水处理的植株,在每一特定的盐度下其光合速率均高于另外两组处理（100％ASW和200％ASW）,并且3个处理的光合速率均与其PEPC在不同盐度下的活性表现相一致。但是,经150％ASW处理的大叶藻植株是否受到盐害还有待于进一步探讨。实验表明“大叶藻耐盐性在一定程度上是由于其代谢酶对盐度的耐性造成的”这一说法是不合适的;不存在蒸腾作用可能是大叶藻耐盐机理的重要组成部分。     

精胺与亚精胺对光照下玉米离体叶片光合羧化酶活性的影响（简报）

玉米离体叶片在光下衰老时,其RuBPC、PEPCase和PPDK（丙酮酸磷酸二激酶）活性逐渐降低。精胺（Spm）和亚精胺（Spd）可阻止这三种酶的活性下降,还可阻止叶绿素和可溶性蛋白含量下降,延缓光下玉米离体叶片的衰老。     

昆虫脂肪酸合成通路关键基因的研究进展

脂肪酸对昆虫生长、发育、繁殖、信息交流起到重要的作用。主要介绍脂肪酸合成通路中的5个关键基因,乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC)、脂肪酸合成酶基因(FAS)、超长链脂肪酸延伸酶基因(ELO)、去饱和酶基因(desat)及脂酰辅酶A还原酶基因(FAR)在昆虫中的研究进展。