A组轮状病毒可视化RT-LAMP方法的建立

【目的】建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并应用于人A组轮状病毒的基因检测。【方法】针对A组轮状病毒VP6基因的6个保守区域设计4条特异性引物,在64 °C恒温条件下进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料钙黄绿素(Calcein)作为反应指示剂,以钙黄绿素的颜色变化作为结果判定标准。评价该方法的特异性和灵敏度,并同时利用RT-LAMP和RT-PCR两种方法对90份临床腹泻样本中的病毒核酸进行检测。【结果】RT-LAMP方法特异性较高,灵敏度可以达到103 copies/μL RNA分子水平,比RT-PCR高出100倍。对临床标本的检出率与RT-PCR方法相当。【结论】建立的RT-LAMP法灵敏度较高,特异性强,节省时间,结果可视化,具有野外检测和现场快速检测的潜力。     

丙烯酸酯-PEG400复合薄膜对胰岛素的体外控释研究

目的：在胰岛索非注射给药研究中,经皮给药系统凭借其独特的优势,已成为近年来医药领域的研发重点。控释膜的研究是经皮给药系统中一个重要组成部分,然而涉及胰岛素通过控释膜释放的研究报道不多。本实验室通过紫外光催化技术合成出一种丙烯酸酯-PEG复合薄膜作为胰岛素控释膜。本实验目的在于考察该复合薄膜在24小时内对胰岛素的体外控释作用,从而为胰岛素经皮给药制剂的基础研究作出贡献。方法：通过紫外光固化方法合成丙烯酸酯-PEG400复合薄膜,通过HPLC的方法考察丙烯酸酯-PEG400复合薄膜对不同浓度胰岛素溶液的控释作用,通过比较薄膜对不同浓度胰岛素溶液的累积渗透量及渗透速率等参数,研究薄膜对胰岛索的控释规律。结果：实验数据显示：丙烯酸酯-PEG复合薄膜对3．0mg／mL,6．0mg／mL,9．0mg／mL这三种不同浓度胰岛素控释曲线的相关因子分别为：0．9921,0．9950,0．9964。相关因子均大于0．99,表明该薄膜能很好的控制胰岛素溶液实现线性释放。经计算,薄膜对3．0mg／mL,6．0mg／mL,9．0mg／mL这三种浓度胰岛素的累积渗透量分别为：266．69μg／cm-2,343．65μg／cm-2,460．10μg／cm2。渗透速率分别为：9．24μg／cm-2·h-1,13．40μg／cm-2·h-1,19．04μg／cm-2·h-1。以上两组数据表明,薄膜对胰岛素的累积渗透量及渗透速率随胰岛素浓度的增加而增大。结论：通过实验结果我们可以看出,丙烯酸酯一PEG复合薄膜能控制不同浓度的胰岛素溶液以恒定速率释放,通过对比薄膜对各浓度胰岛素的累积渗透量及渗透速率等参数,发现该薄膜对胰岛素的释放速率受胰岛素浓度调节,具体表现为随胰岛素浓度的增加而增加。因此该薄膜不仅可以稳定控制胰岛素实现零级释放,而且可以通过调节胰岛素浓度实现调节胰岛素释放速率的目的。由此可以看出,该薄膜是一种理想的胰岛素控释膜。同时本实验作为胰岛素控释膜的基础研究,也为日后以该薄膜为控释膜的胰岛素经皮给药制剂的研发打下了坚实的基础。     

Photoreceptor-Mediated Bending towards UV-B in Arabidopsis

Plants reorient their growth towards light to optimize photosynthetic light capture--a process known as phototropism. Phototropins are the photoreceptors essential for phototropic growth towards blue and ultraviolet-A （UV- A） light. Here we detail a phototropic response towards UV-B in etiolated Arabidopsis seedlings. We report that early differential growth is mediated by phototropins but clear phototropic bending to UV-B is maintained in photl phot2 double mutants. We further show that this phototropin-independent phototropic response to UV-B requires the UVoB photoreceptor UVR8. Broad UV-B-mediated repression of auxin-responsive genes suggests that UVR8 regulates directional bending by affecting auxin signaling. Kinetic analysis shows that UVR8-dependent directional bending occurs later than the phototropin response. We conclude that plants may use the full short-wavelength spectrum of sunlight to efficiently reorient photosynthetic tissue with incoming light.     

荧光重组酶介导等温扩增检测食品中单增李斯特菌

[背景] 单增李斯特菌为肉类及乳制品中常见的食源性致病菌,传统的培养法检测无法满足口岸大批量食品的快速检测要求,建立简便、灵敏、快速及现场可操作的技术至关重要。[目的] 建立快速简便的荧光重组酶介导等温扩增（Recombinase-Aided Amplification,RAA）法检测单增李斯特菌,以适应口岸快速通关及监管的实际需求。[方法] 根据单增李斯特菌hlyA基因保守区设计特异性引物、探针,通过引物两两组合结合探针筛选出扩增效率及灵敏度最佳的引物组合,优化反应温度及引物探针浓度,确定最佳反应条件。将建立的荧光RAA法应用于食品基质及实际样品检测中,同时与国标GB 4789.30-2016进行比对验证。[结果] 单增李斯特菌荧光RAA最佳反应温度为42 ℃,最佳引物、探针终浓度均为400 nmol/L。建立的荧光RAA法特异性强,纯菌灵敏度达到3×10² CFU/mL。加标食品基质牛肉、大西洋鲑鱼及再制干酪LB2增菌只需4 h,即可检测原始浓度分别达到0.3、3、30 CFU/mL的单增李斯特菌。荧光RAA法只需5 min即可观察结果,20-30 min完成扩增,速度及灵敏度明显高于国标法。[结论] 建立的荧光RAA法可用于口岸和其他场所进行单增李斯特菌的快速检测与监控。     

重庆市北碚区宠物源沙门氏菌耐药性监测及ESBL和PMQR基因检测

【背景】沙门氏菌是一种常见的人兽共患病病原菌。随着饲养宠物的人越来越多,宠物肠道内沙门氏菌对公共卫生的威胁逐渐显现,但鲜见宠物携带沙门氏菌的流行病学及宠物源沙门氏菌耐药性的报道。【目的】了解重庆市北碚区宠物源沙门氏菌的流行情况,以及其对常用抗菌药物的敏感性及超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBL)基因和质粒介导的喹诺酮耐药(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance,PMQR)基因的携带情况。【方法】共采集北碚区宠物粪便样品1 038份,通过样品前增菌、选择性增菌、选择性平板筛选和PCR鉴定沙门氏菌特异性invA基因分离鉴定沙门氏菌;接着测定了分离菌株对28种抗菌药物的敏感性,检测了10种ESBL基因和10种PMQR基因。【结果】共分离到沙门氏菌41株,分离率为3.95%。这些菌株对磺胺异噁唑、氨苄西林、四环素、多西环素的耐药率都超过50%,而且82.92%为多重耐药菌株,对阿米卡星、氧氟沙星、依诺沙星、加替沙星完全敏感;85.37%的分离菌携带ESBL基因,以blaTEM基因最为流行;46.34%携带PMQR基因,以qnrS最为流行;48.57%的ESBL阳性菌株携带至少一种PMQR基因。【结论】北碚区宠物体内的沙门氏菌对一些抗菌药物存在不同程度的耐药性,而且耐药性可能是通过耐药质粒介导的。     

环介导等温扩增技术的应用进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新式核酸扩增技术,它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶与2对特殊设计的引物,在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应。相较于传统扩增检测方法,LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点,更能在现场快速检测和基层应用中广泛推广,目前LAMP技术已广泛应用于植物病害检测、动物病害检测、食品安全检测等领域。基于此,简要介绍了LAMP技术的基本原理、反应产物的检测方法,重点阐述了LAMP技术的改进与发展,综述了近年来其在科研生产中的应用进展,并对其发展前景进行了展望,以期为LAMP技术的进一步发展提供合理的研究方向。     

环介导恒温扩增法快速检测短小芽孢杆菌

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)是一种能引起食源性疾病的腐败菌,对其进行快速检测具有重要意义。针对短小芽孢杆菌木聚糖(xynA)基因,设计了4条特异性引物(两条内引物和两条外引物),通过条件优化,首次将一种新颖的核酸扩增技术——环介导恒温扩增技术应用于短小芽孢杆菌的快速检测。采用该技术,63℃温育1h的条件下扩增短小芽孢杆菌DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带。PCR和LAMP的检测灵敏度分别约为162和16.2拷贝每反应。结果表明,该方法检测短小芽孢杆菌特异性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低,1h即可完成,有望发展成为快速检测短小芽孢杆菌的有效手段。     

绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼细胞中的表达

主要研究绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼(缘管浒苔)细胞中的表述.应用绿色荧光蛋白基因、抗除草剂bar基因、CMV 35S启动子和SV40双启动子构建了质粒载体PSV-bar-ZsGeen,采用改进的PEG法将质粒载体PSV-bar-Zs-Geen导入到缘管浒苔原生质体中,经过细胞培养发育再生藻株,通过除草剂筛选出阳性藻株,且转化率达38.58％,进一步PCR分子检测和显微荧光检测表明,绿色荧光蛋白基因在转基因植株中得到表达,为今后转基因浒苔研究奠定基础.     

一种根癌农杆菌介导的简单、快捷转化雪柑的新方法

以雪柑种子为外植体,以pC1301-PMI-LFY重组载体为转化载体,将蘸有农杆菌侵染液的接种针在种子胚的顶端分生组织部位刺2-3次,深度1 mm左右,当实生苗成活后移栽.通过PCR检测和PCR-Southern杂交检测得到了1株转基因植株,转化率为4.35％.针刺法简便快速,在雪柑上能够成功应用,为木本植物的遗传转化提供了新的思路.