菊芋HtCCR1基因的克隆与表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素合成代谢的关键酶。该研究以菊芋(Helianthus tuberosus L.)‘廊芋8号’为材料,克隆到1个菊芋的CCR基因,命名为HtCCR1(GenBank登录号为MN205540),其开放阅读框(ORF)长975bp,编码324个氨基酸,其中含有FR_SDR_e保守结构域。系统进化分析表明,HtCCR1与向日葵CCR蛋白(XP_021989763.1)共聚于一支,二者亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,HtCCR1基因在菊芋茎和叶中的表达量显著高于在根和块茎中;盐(150mmol·L-1 NaCl)胁迫处理6、12和24h后,处理组HtCCR1基因的表达量均显著高于对照组;干旱(20%PEG6000)胁迫6和12h后,处理组HtCCR1基因的表达较对照组均显著上调。成功构建pET-28a-HtCCR1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导出了符合预期大小的蛋白,表明HtCCR1重组蛋白已成功表达。该研究结果为进一步研究HtCCR1基因的功能及利用基因工程手段调节菊芋中木质素的生物合成奠定了基础。     

扶桑绵粉蚧组织蛋白酶B基因的克隆、原核表达和不同发育阶段表达分析

昆虫组织蛋白酶B在昆虫代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RACE技术克隆了扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley组织蛋白酶B基因的开放阅读框（ORF）序列, 命名为PsCb （GenBank登录号: JQ727999）。生物信息学分析表明, 该基因的开放阅读框包含927 bp的片段, 编码308个氨基酸。多序列比对表明, 该基因编码的蛋白在N端变异较大, 在C端保守性高。组织蛋白酶B基因的系统进化树结果表明扶桑绵粉蚧组织蛋白酶独自成为一支。原核表达电泳检测到一条大约35 kDa的目的条带, 与预测的蛋白分子量相符。组织蛋白酶B基因在扶桑绵粉蚧各个虫态均有表达, 卵期表达量相对较低, 2龄若虫期达到最高峰, 然后下降。本研究为进一步研究该基因的功能并开发出组织蛋白酶抑制剂, 从而研制出扶桑绵粉蚧杀卵剂和胚胎发育抑制剂等提供理论依据。     

《细胞研究》：研究综述G蛋白偶联受体表达和功能改变新发现

近日上海同济大学生命科学与技术学院在《细胞研究》（CellResearch）杂志上发表了题为”Gprotein-coupledreceptorsastherapeutictargetsformultiplesclerosis”（G蛋白偶联受体作为多发性硬化症治疗靶点）的综述文章。     

脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆,构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体,实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达,并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性。利用Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB;再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB,将这两个表达载体分别电转至Pf-5中,通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子,以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活,并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响。本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931. 1 and AJK49932. 1);成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB,并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性;以LB培养基培养至24 h时,启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2. 1倍;在LB培养基摇瓶发酵至66 h时,Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13. 51 U/mL,而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46. 85 U/mL,是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3. 47倍。初步实现基因lipA在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高,为将来实现规模化生产奠定了技术基础。     

一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析

用接头PCR技术克隆了长度为1415 bp的PNZIP基因启动子, 该启动子具有真核生物启动子的典型特征, 引物延伸实验证明转录起始位点位于翻译起始位点上游122 bp处. 根据PNZIP基因启动子的序列特征, 利用PCR技术对该启动子进行了有目的的缺失, 将5个长度不同的启动子片段分别与报告基因GUS相连接, 构建植物表达载体, 转化烟草. 荧光定量检测结果表明: 5个不同长度的PNZIP启动子均能驱动GUS基因在光合组织中专一表达, 它们的活性随着启动子5′端的逐步缺失而不断地下降; 在叶片组织中长度为1415 bp的PNZIP启动子活性比35S启动子高9倍; PNZIP启动子中存在2个可能与光合组织特异表达有关的新的顺式作用元件, 即GAAATA和GATACT, GATACT元件可能决定基因的光合组织特异性表达, 而GAAATA可能作为增强子提高基因在光合组织的表达强度.     

P—选择素凝集素—EGF功能域的克隆、表达及其单克隆抗体制备

制备特异性抗人P 选择素的凝集素 表皮生长因子 (L EGF)功能域的单克隆抗体。利用特异引物 ,通过RT PCR从外周血血小板中扩增出人P 选择素的L EGF功能域基因 ,将其克隆至pET42b( )载体中 ,测序验证后转染大肠杆菌BL2 1,经诱导表达了C端融合 6×His的蛋白质。融合蛋白质经分离纯化后 ,免疫Balb/c小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,通过间接ELISA筛选阳性克隆。获得 3株可稳定分泌抗L EGF功能域单抗的杂交瘤细胞株 (B10、F3和H5 )。其亚型分别为IgG2 、IgG1和IgG3;轻链均为κ型。所获的单抗对LPS刺激活化的人脐静脉内皮细胞均有特异性结合反应 ,并可在体外阻断经凝血酶激活的血小板与中性粒细胞间的粘附。表明所获的单抗可特异性识别结合天然P 选择素 ,具有体外抗活化血小板与中性粒细胞粘附的功能 ,为进一步应用此单抗进行P 选择素结构和功能及抗粘附治疗研究提供了实验基础。     

P53，Rb和c－myc基因在人脑原发性肿瘤中的转录表达

采用RNA斑点杂交分析,对21例人脑原发性胶质瘤和11例人脑膜瘤中p53,Rb和c-myc基因转录水平的表达进行研究.发现48.4%的肿瘤中p53基因表达减弱,21.9%的肿瘤中Rb基因表达减弱;71.9%的肿瘤中c-myc基因表达增强.在p53基因表达减弱的15例病例中有13例(80%)c-myc基因表达增强.结果表明,p53基因表达减弱和c-myc基因表达增强与人脑原发性肿瘤的发生有关.     

我国病毒基因工程研究进展——λ基因在大肠杆菌中获得功能表达

中国科学院微生物研究所范云六等已建成了带有λ DNA或复制区的重组质粒即pAGS和pAG82,pAG 5在大肠杆菌(C600PoIAts)中无性繁殖,pAG82不仅在大肠杆菌中进行无性繁殖,而且得到功能表达。中国科学院细胞生物研究所匡达人等     

芪合酶基因Fm-STS在何首乌毛状根中的过量表达分析

目的:通过过量表达探究在何首乌中得到的芪合酶基因Fm-STS的功能.方法:由含CaMV 35S启动子驱动以及荧光标记蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的植物转基因基础表达质粒pBIN-35S-GFP构建过量表达质粒pBIN-35S-STS-GFP(阳性),并同空白表达质粒pBIN-35S-GFP(空白)均导入野生型发根农杆菌ATCC15834中,转化何首乌外植体(无菌苗叶片),诱导生成毛状根并培养,对毛状根进行高效液相色谱分析芪合物二苯乙烯苷含量变化以及实时荧光定量检测基因Fm-STS表达差异.结果:在过表达组和空白组中毛状根中发根农杆菌Ri质粒中的rolB基因和外源基因GFP均有表达,芪合物二苯乙烯苷含量依次为4.67 mg/g和2.18 mg/g(干重),在mRNA水平上检测基因Fm-STS表达量:过表达组是空白组的2.41倍.结论:基因FM-STS是何首乌中芪合物二苯乙烯苷生物合成过程中的酶基因,过量表达在基因功能研究中有良好的应用.     

烟芽夜蛾囊泡病毒3h株编码的3H-117蛋白能干扰AcMNPV的口服活性

[目的]囊泡病毒是一类体液传播的昆虫病毒,具有特殊的致病历程和良好的生防应用潜力.烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h)是我国分离的第一株囊泡病毒,其编码的3H-117蛋白被报道为HvAV-3h病毒粒子的结构蛋白.[方法]为了进一步探究3h-117基因...