豚鼠球囊毛细胞的分离及钾离子流的研究

目的：研究前庭毛细胞的细胞活性及膜上钾通道的类型。方法：用酶深化后机械法分离豚鼠球囊毛细胞,并用全细胞膜片钳观察豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上的钾通道电流。结果：①胶原酶Ⅳ浓度为０．３５ｍｇ／ｍｌ时,分离的毛细胞数量最多,存活时间最长;②当钳制电位为－１００ｍＶ,以１０ｍＶ的步距,从－７０ｍＶ至＋２０ｍＶ阶跃,随着膜 电位的去极化,可记录到一系列快速、瞬时的以Ａ型钾通道为主的外向电流,４－Ａｐ对其有特异     

乙酰胆碱及其拮抗剂对蚕豆保卫细胞内向钾电流的调节作用

用膜片钳全细胞记录方式记录蚕豆保卫细胞原生质体内向钾电流,结果发现,低浓度乙酰胆碱处理促进内向钾电流,高浓度乙酰胆碱处理则抑制内向钾电流.乙酰胆碱受体的拮抗剂d-管箭毒和阿托品分别抑制的内向钾电流约30%;同时使用d-管箭毒和阿托品则抑制60%～75%的内向钾电流,四乙铵离子处理不影响乙酰胆碱调节的内向钾电流.以上结果表明,乙酰胆碱及其受体可能是通过调节保卫细胞质膜上的内向钾通道参与对气孔运动的调节.     

乙酰胆碱协同剂对蚕豆保卫细胞原生质体内向钾电流的调节作用

用膜片钳全细胞记录方式研究了乙酰胆碱对蚕豆保卫细胞原生质体内向钾电流的作用与机理。发现乙酰胆碱的协同剂———烟碱和毒蕈碱分别促进内向钾电流 30 %～ 40 %。EGTA处理能有效减弱毒蕈碱对内向钾电流的促进效应 ,但不影响烟碱对内向电流的促进效应。这些结果提示 ,乙酰胆碱促进气孔开放的作用可能是通过受体直接或间接调节内向钾电流实现的     

二甲双胍对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的HT22细胞损伤的保护作用

该文探究二甲双胍(metformin,Met)对N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)诱导的HT22细胞损伤的神经保护作用。体外培养HT22细胞,建立NMDA诱导HT22细胞神经损伤模型,给予不同浓度的Met预保护,检测细胞存活率,确定Met预保护最佳浓度;Hoechst33342染色拍照观察细胞凋亡;相应试剂盒检测培养基上清中乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)的含量;Western blot检测突触蛋白PSD95、NR2B以及AMPK、p-AMPK的表达情况。结果显示,与对照组相比,NMDA可明显导致HT22细胞损伤,4 mmol/L Met,对其诱导的细胞神经损伤有最大保护作用;模型组中,NMDA损伤导致HT22细胞凋亡,LDH活性升高,SOD活性降低,MDA含量升高,Met预保护均能逆转以上变化;Met还能上调PSD95、NR2B、p-AMPK的表达。总之,Met可能是通过激活AMPK,调节PSD95/NR2B信号通路并发挥神经保护作用的。     

二性霉素B与β-escin混合穿孔电极液在人心房肌细胞SK2电流记录中的应用

目的:为研究钙离子对人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流(ISK2)的调节作用,建立用二性霉素B(amphotericin B)与β-escin穿孔的膜片钳(PPR)技术。方法:体外循环术中取得右心耳,应用急性酶分离获得单个人体心房肌细胞,用二性霉素B和/或β-escin作为穿孔电极液,进行穿孔膜片钳实验,在此模式下测试钙离子对人心房肌细胞SK2电流的调控作用,并用胞内钙测试系统验证穿孔前后胞内钙变化。结果:混合使用穿孔电极液6.88μg/mlβ-escin和150μg/ml二性霉素B与单独用150μg/ml二性霉素B或6.88μg/mlβ-escin相比,前一种方法细胞容易封接,能形成稳定的穿孔膜片钳记录模式,可观察到SK2电流有激活,且胞内钙测试系统检测时可观察到穿孔后电极液至细胞内的游离钙离子浓度的增加,F340/380增强。结论:适当浓度的二性霉素B与β-escin混合使用进行穿孔膜片钳实验是一种稳定的全细胞膜片的记录技术,可以用于胞内游离钙离子对SK2电流调控的研究。     

NMDA受体亚单位NR2B的结构、功能特性及其表达与调控

NMDA受体是兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu)的特异性受体,属配体门控离子通道,是由不同的亚单位组成.现已发现,NMDA受体至少存在7个亚单位(NR1,NR2A-D,NR3A-B),其中NR2B在7个亚单位中扮演非常重要的角色.近年来对NR2B研究表明,其在调控神经元突触的可塑性、学习与记忆以及治疗精神紊乱方面具有重要的意义.对近期有关NR2B亚单位的结构、功能特性及其表达与调控的研究进展做一综述.     

不饱和脂肪酸在低渗牵张加强豚鼠胃窦平滑肌细胞毒蕈碱电流中的作用

利用全细胞膜片钳技术在急性分离的胃窦平滑肌细胞上记录离子电流的方法 ,探讨外源性不饱和脂肪酸是否参与低渗牵张加强毒蕈碱电流的过程。在豚鼠胃窦平滑肌细胞上膜电位被钳制在 - 2 0 0mV等渗状态时 ,5 0 μmol/L卡巴胆碱 (carbachol,CCh)引起的毒蕈碱电流 (ICCh)作为对照 ,发现低渗牵张可以使ICCh明显增加到对照的 2 2 6 0±2 1 0 %。当用含 5 μmol花生四烯酸 (arachidacid ,AA)、亚麻酸 (linoleicacid ,LA)或亚油酸 (oleicacid,OA)细胞外液灌流时 ,ICCh分别被抑制在对照的 3 8± 0 6%、3 5 2± 0 8%和 66 6± 0 6%。在这种情况下 ,低渗牵张刺激可以使ICCh分别增加到 10 6 0± 2 5 %、173 2± 6 8%和 2 2 2 1± 11 0 %。 5 μmol/LAA抑制低渗牵张增加的毒蕈碱电流 5 1 2± 3 8% ,而在等渗状态下抑制ICCh为 96 2± 1 6%。上述结果提示 ,不饱和脂肪酸中双键数目越多 ,抑制效应越强 ;但不饱和脂肪酸不参与低渗刺激加强毒蕈碱电流的过程。     

小剂量辣椒素对豚鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响

应用全细胞膜片钳技术研究低浓度辣椒素(capsaicin,CAP)对单个豚鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响及其作用机制.CAP(1～25 nmol/L)可浓度依赖性增加电压依赖性的ICa-L的峰值并下移I-V曲线.CAPl,10,25 nmol/L使ICa-L最大峰值分别由-9.67±0.7pA/pF增至-10.21±0.8pA/pF(P＞0.05),-11.37±0.8pA/pF和-12.84±0.9pA/pF(P＜0.05).CAP25nmol/L可明显使稳态激活曲线左移,激活中点电压(V0.5)由-20.76±2.0mV变至-26.71±3.0mV(P＜0.05),表明低浓度CAP改变了钙通道激活的电压依赖性.CAP25nmol/L对电压依赖性稳态失活曲线和ICa-L从失活状态下复活过程无明显影响.辣椒素受体(VR1)阻断剂钌红(RR,10μmol/L)可阻断低浓度辣椒素的效应.以上结果表明,低浓度辣椒素使钙通道稳态激活曲线左移,增加ICa-L,这一效应可能由VRl介导.     

白介素-6对NMDA诱导的小脑神经元放电活动的抑制作用及其机制

目的：观察白介素-6（IL-6）对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）激发的神经元放电活动的影响及其可能的作用机制。方法：用含IL-6、NMDA和JAK抑制剂ACA90的人工脑脊液（ACSF）灌流小脑脑片,利用离体脑片神经元单位放电细胞外记录技术,记录药物对小脑间位核神经元放电的影响。用Western blot法测定间位核神经元NMDA受体亚单位1（NRI）的磷酸化水平。结果：单独用12．5μmol／L和25μmol／LNMDA灌流,神经元放电频率均较基础放电频率增加;用不同浓度IL-6（50,100,200μg／ml）联合NMDA作用后,神经尤的放电频率出现浓度依赖性地降低;AG490可部分阻断IL-6对NMDA兴奋神经元放电的抑制作用。与单独NMDA处理组比较,用IL-6联合NMDA处理神经元后,神经元的NR1磷酸化水平出现浓度依赖性地降低。AG490可阻断IL-6所致的神经元NR1磷酸化水平的降低。结论：IL-6可抑制NMDA激发的小脑间位核神经元的放电兴奋活动;并同时下调神经元的NR1磷酸化水平。     

琥珀酸对大鼠海马CA1区神经元电压依赖性钙电流的影响

目的：观察不同浓度的琥珀酸对大鼠海马CA1区神经元电压依赖性钙通道（voltage—dependent calcium channels,VDCC）电流的作用,初步探讨琥珀酸对神经元保护的电生理学基础。方法：采用传统全细胞膜片钳技术和制霉菌素（nystatin）穿孔膜片钳技术观察琥珀酸对海马CA1区神经元VDCC电流的影响。结果：不同浓度的琥珀酸（10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2和10^-1mol·L^-1）在海马CA1区对低电压激活（low—voltage activated,LVA）钙通道电流未见任何影响,而对高电压激活（high—voltage activated,HVA）钙通道电流的抑制呈浓度依赖性。对照组HVA钙电流为580．05±17．32pA,分别给予10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2和10^-1mol·L^-1。的琥珀酸后,HVA钙电流依次为563．74±16．65,517．99±15．24,444．66±13．26,405．32±19．11,269．03±9．96和86．41±3．25pA,同对照组相比差异有统计学意义（n=8,P〈0．01）。结论：琥珀酸能浓度依赖性地抑制HVA钙电流,而对LVA钙电流无影响。由此推测琥珀酸可能通过抑制HVA钙电流减少Ca^2＋内流而影响海马CA1区神经元的兴奋性,从而抑制癫痫的形成,其脑保护作用可能与此有关。