双光子显微镜在生物医学中的应用及其进展

光学显微镜的发展历史是一段不断提高显微镜的分辨率和对比度的历史。双光子显微镜是近30年来非线性显微镜的研究发展的代表。它在分辨率上与共聚焦显微镜相当,但在成像的层析穿透深度上有显著提高,并且大大减少了光毒性与光漂白。由于生物细胞组织中富有各种自家荧光源,因此双光子显微镜被广泛应用于皮肤组织甚至癌组织以及细胞的成像。基于共聚焦扫描显微镜的双光子显微镜可以很容易的与二次谐波显微镜组合,对皮肤组织中的重要成分胶原纤维进行成像。双光子显微镜还可以结合其他非线性光学现象对组织以及细胞进行成像,显示其强大的生命力。将来随着携带方便且廉价的双光子显微镜的出现,双光子显微镜有望在临床医学上发挥其有效的作用。     

沉默抑制子CMV 2b基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建

从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本,取ELISA检测阳性反应最强的样本提取总RNA。设计特异性引物扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。将来源于安徽烟草的CMV 2b基因与其它CMV 2b基因进行序列比对,结果表明,来源于安徽烟草的CMV 2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8%。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段CMV 2b（r）和反向片段CMV 2b（i）。先后将反向片段CMV 2b（i）和正向片段CMV 2b（r）分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b（r）-In-2b（i）。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）。     

采用系统生物学方法分析乳腺癌转移中Runx2对细胞外基质重塑的调节机制

摘要细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重塑是癌细胞迁移的关键步骤.本研究基于乳腺癌组织的基因表达谱数据,采用系统生物学方法推测乳腺癌转移中Runx2对细胞外基质重塑的调节机制.采用相关性分析程序分析49例乳腺原发癌和15例淋巴结转移癌组织的基因表达谱数据,筛选与Runx2呈相关性表达的基因,结果得到与ECM重塑相关的候选基因52个,包括ECM成分11个,ECM降解酶及其抑制剂8个,细胞信号分子33个.利用转录调节因子结合序列数据库搜索候选基因启动子区的Runx2结合模序,筛选其中Runx2转录调控的ECM重塑相关基因,并判断可能调节Runx2的上游信号分子;文献检索实验证实的与Runx2有相互调节关系的基因,并基于Runx2上游调控信号分子和下游转录调节基因的分析,构建得到以Runx2为中心的ECM重塑的生物学调控网络.WNT和TGF/BMPs是启动Runx2表达的主要信号通路,Runx2通过转录调节ECM组分、ECM降解酶及其抑制剂和信号分子调节ECM重塑,促进癌细胞完成转移的生物学过程.     

温度对Cd抑制土壤脲酶影响机理研究

通过土壤培养实验、紫外光谱和荧光光谱技术,研究了不同温度下Cd对土壤脲酶催化活性、动力学性质的影响及其机理。结果表明：（1）在供试温度范围内,土壤脲酶活性、动力学参数Vmax和Vmax/Km值与温度呈正相关,且土壤脲酶活性随着培养时间延长呈现先增后减的趋势; （2）土壤脲酶活性、动力学参数Vmax和Vmax/Km值与Cd^2＋呈显著负相关,表明Cd对土壤脲酶的抑制作用为非竞争性抑制,且抑制程度随处理温度升高而加强; （3）低浓度Cd处理刀豆脲酶后,随着体系中Cd^2＋的增加,脲酶的紫外吸收光谱发生红移,荧光发射峰发生蓝移。 关     

静态荧光光谱法研究杜氏盐藻的生长规律

测量了杜氏盐藻不同生长期的静态荧光光谱,得出了杜氏盐藻生长规律曲线。通过与传统的分光光度计法和血球计数板法研究盐藻生长规律的比较发现,该方法反映的是活盐藻细胞浓度的变化情况,更能反映盐藻实际生长规律;不仅操作简便,灵敏度高,而且可以实现远距离非接触测量。     

GWAS在2型糖尿病相关基因研究中的应用

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)是一种常见的复杂疾病,其发病受到遗传和环境因素的共同作用.全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)是一种可在全基因组范围筛查疾病相关的序列变异的新型群体关联研究方法.近年来,采用GWAS以及在此基础上展开的meta分析,已分别在TCF7L2、HHEX-IDE、SLC30A8、CDKAL1、CDKN2A-CDKN2B、IGF2BP2、NOTCH2、CDC123-CAMK1D、ADAMTS9、THADA、TSPAN8-LGR5、JAZF1等12个基因区域鉴定出多个T2D相关的多态位点.已有的研究提示,上述多个基因可能在胰岛β细胞发育和功能维持方面扮演着重要角色.本文集中介绍了GWAS的原理及其在T2D研究中的优势;回顾了GWAS在T2D研究中的主要发现;并对运用GWAS在T2D研究中尚需解决的问题进行了总结和展望.     

基于时域的时间分辨荧光光谱的蒙特卡洛模拟

利用蒙特卡洛方法构建了生物组织基于时域的时间分辨荧光光谱的仿真模型,并将应用该模型获得的模拟结果与生物组织的实验光谱进行了比较。结果表明：吸收系数与散射系数分别影响光谱的不同区域;低浓度情况下,模拟结果与实验光谱符合得较好（x^2〈1．2）;高浓度下,实验光谱强度会被浓度效应削弱,以致影响其与模拟光谱的吻合程度。该方法为研究生物组织荧光光谱提供了一种新思路。     

过表达Sirt2抑制猪前体脂肪细胞的分化

本文旨在利用过表达技术研究Sirt2在猪前体脂肪细胞分化中的作用.首先将Sirt2插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,并与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,重组体用Lipofectamine2000包装转染HEK293细胞系,成功获得重组腺病毒vAd-Sirt2.用vAd-Sirt2感染猪前体脂肪细胞,48h后油红O染色法观察脂肪细胞分化情况,RT-PCR检测脂肪细胞分化标志基因PPARγ和aP2的表达.结果显示,过表达Sirt2促使细胞中脂滴减少,同时标志基因PPARγ、aP2mRNA水平显著降低,说明Sirt2抑制猪前体脂肪细胞分化,这为控制猪体脂沉积提供依据以及为人类肥胖和相关疾病的治疗和预防奠定基础.     

慢病毒介导的甲胎蛋白敲减表达抑制肝癌细胞HepG2的增殖

甲胎蛋白（AFP）是原发性肝癌的标志物.本实验室前期研究表明,AFP的表达与肝癌细胞的增殖及细胞周期相关.为了建立高效稳定的AFPsiRNA细胞导入方法,本研究构建了AFP慢病毒siRNA干涉载体pRNAT-U6.2/AFPsiRNA.并将其转入HEK293细胞后,Western 印迹表明,pRNAT-U6.2/AFPsiRNA的干扰效率为88.7%（P<0.05）. pRNAT-U6.2/AFPsiRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞包装成慢病毒后感染HepG2细胞,感染3 d时GFP的表达量达95%,感染35 d的子代细胞中GFP的表达量仍稳定在85%.GFP表达量的观察显示,慢病毒载体可以高效并稳定表达外源基因. Western 印迹结果也显示,HepG2细胞被病毒感染3 d和25 d后,AFP表达水平均有降低,抑制率分别为74.8%和63.4%(P<0.05).克隆形成实验表明,AFP沉默后,细胞克隆形成个数降低63%(P<0.01),表明HepG2细胞增殖能力受到抑制.     

实时荧光PCR结果的四维杂交的核酸技术分析

本研究采用四维杂交试剂,测定PCR产物的特征熔点温度(temperature of melting point,Tmp),对实时荧光定量PCR所获得阳性信号(特异性的或非特异性的)的结果进行分析和确认,以使检测结论更客观.将荧光探针模式的实时荧光PCR检测后的标本再进行熔解曲线温度扫描,然后在4℃冰箱冷却5min,向反应管加入1μL四维杂交液,再按照温度扫描程序做熔解曲线实验.结果显示,加四维杂交试剂之后的熔解曲线中信号峰值是收敛的,且信噪比增大.相同扩增产物的Tmp的误差是在±1℃之内.实验结果证明,四维杂交试剂对荧光探针模式实时荧光PCR结果可进行更精细的分析和确认.