家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

鱼类生殖细胞移植的研究进展

生殖细胞移植在生物学、畜牧学及兴起的鱼类生物工程上都有很多用途。目前,采用基于基因组的育种方法已选育出多种带有所需遗传性状的鱼类新品系;但由于缺乏鱼卵与胚胎的低温保存技术,尚未找到长期保存其种质资源的方法。就鱼类生殖细胞移植的最新研究进展进行综述,同时针对鱼类生殖细胞移植及其低温保存技术研究中存在的问题进行讨论,并提出了鱼类生殖细胞移植的应用前景,以期能积极推动鱼类生物工程的研究,加速鱼类生殖细胞移植在产业中的应用。     

全反式维甲酸体外诱导P19细胞向心肌方向分化

目的探讨不同浓度全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导P19细胞向心肌分化的效力。方法细胞分成P19细胞组,2nm/L atRA诱导组,5nm/L atRA诱导组,8nm/L atRA诱导组。各组细胞经过诱导、聚集培养、聚集体贴壁培养10天后,RT-PCR检测GATA-4,α-肌球蛋白重链(α-myosin heavychain,α-MHC)的mRNA表达,免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT蛋白共表达,Western blot检测cTnT的蛋白表达。结果 atRA可诱导聚集P19细胞表达GA-TA-4、a-MHC mRNA;α-sarcomeric actin和cTnT的表达和共表达增加;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组GATA-4、a-MHCmRNA的表达量显著高于P19细胞组;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组两种蛋白的表达和共表达量显著高于P19细胞组,以5nm/L atRA组最高,显著高于其它组。结论 atRA可诱导聚集P19细胞向心肌分化,其中5nm/L atRA组效果最好。     

NF-κB信号和MAPK通路在椎间盘退变中的研究进展

椎间盘退变涉及诸多因素,其中由细胞外基质分解代谢和合成代谢失衡导致的基质减少发挥了很大的作用,但这些变化的发生还没被全部阐明。由丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子kappaB（NF-κB）通路介导的细胞因子在代谢失衡中发挥重要作用,所以,研究细胞因子产生作用的信号转导通路对深入了解椎间盘退变的原因及为其治疗提供了新的方向。对NF-κB和MAPK信号转导通路及其在椎间盘退变中的作用机制加以综述。     

ERK1/2在高温致神经管畸形神经上皮细胞中的表达变化

目的 探讨高温致神经管畸形(NTDs)作用的分子机制,为防治NTDs的发生提供理论依据.方法 在高温致金黄地鼠NTDs模型的基础上,应用免疫荧光染色技术,观察NTDs发生过程中p-ERK1/2在鼠胚神经上皮细胞中的表达变化.结果 对照组和实验组孕鼠在高温水浴处理后16、24h,p-ERK1/2免疫阳性产物分布于鼠胚神经上皮细胞和周围间充质细胞的胞浆中;水浴后36、60h,p-ERK1/2表达部位出现了由细胞浆向细胞核的转移;高温处理后,p-ERK1/2在实验组各期胚胎神经上皮细胞内的表达均比对照组减弱.结论 ERK1/2参与胚胎神经管的发育过程,其表达降低在高温致神经管畸形的发生中起重要作用.     

灰仓鼠多房棘球蚴腹腔动物模型的建立

目的观察多房棘球蚴(Echinococcus muhilocularis E.m)在灰仓鼠腹腔内的生长发育规律,制作E.m灰仓鼠动物模型。方法 2000个E.m原头节/只剂量腹腔接种灰仓鼠,接种后10、15、18、22、39、60、80和100 d,测量包囊重量和抗体,计算包囊重与灰仓鼠体重的包囊系数,观察多房棘球蚴在灰仓鼠体内的发育规律。分别按100个/只、500个/只和2000个/只剂量腹腔接种灰仓鼠各10只,100 d后剖检比较不同感染剂量的包囊发育情况和感染率。结果 62只灰仓鼠中有59只感染了多房棘球蚴。18 d可观察到成熟原头节,感染率达到100%,15 d出现抗体阳性,60 d时包囊系数达到15%以上;100、500和2000三种剂量的感染率100%;结论建立的灰仓鼠腹腔多房棘球蚴动物模型具有感染率高,感染周期短,包囊生长发育和抗体滴度变化易观察,感染60 d可作为E.m动物模型成模观察期。包囊系数,抗体滴度和包囊发育变化可作为造模的主要参考指标。雌性灰仓鼠造模优于雄性。     

固有免疫信号因子TRIF在肝纤维化中的表达

目的初步探讨TOLL样受体下游重要信号因子TRIF与肝纤维化发生发展的病理机制关系。方法以四氯化碳皮下注射+低蛋白高脂饮食+酒精饮料的方法复制大鼠肝纤维化模型。将SD大鼠随机分成正常对照组和模型组,在完成制备模型实验后进行取材。部分实验鼠进行心脏生理盐水和多聚甲醛灌注后,取肝脏组织制备石蜡切片,进行常规HE染色和免疫组化实验;另一部分实验鼠脱颈安乐死后,取新鲜肝组织进行电镜标本的制备和Western Blot实验检测。结果 HE染色结果显示与而正常对照组大鼠相比,模型组大鼠肝小叶结构明显破坏,肝细胞数量明显减少和肝纤维化程度等特点明显;电镜结果也显示,肝纤维化组可见大量胶原纤维沉积现象,胞质可见明显的溶解现象,在狄氏腔内,肝星状细胞的细胞核溶解,血窦内皮细胞胞质、胞核皆溶解;免疫组化模型组大鼠肝组织均显示内皮细胞、星形细胞等TRIF都有强烈高表达,并且以胞核表达为主,亦见胞质表达,而正常组呈现弱阳性表达;与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织TRIF蛋白表达都明显升高,呈显著性差异(P<0.01),与形态学的表达特点相一致。结论 TRIF在肝纤维化中表达显著增强,说明在肝纤维化过程中,TOLL样受体明显激活,并且通过下游信号转导途径,在机体内产生一系列的免疫应答反应。通过该现象的观察,我们初步证实了TOLL样受体固有免疫信号因子TRIF在纤维化形成中起着重要的作用。     

人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定

目的克隆并表达人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株的融合蛋白(F)基因片段。方法利用PCR技术扩增HRSV兰州株的融合蛋白基因片段,克隆于原核表达载体pET-42b(+),转化大肠杆菌(Rosetta),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。结果 PCR扩增得到951 bp的DNA片段,重组质粒pET42b-F经酶切鉴定和测序分析,表明质粒构建正确。表达的重组蛋白的相对分子质量为68 710,表达的重组蛋白占总菌体蛋白的7%,纯化后蛋白纯度达80%。经Western-blot分析,重组蛋白与抗RSV的单抗呈专一性强阳性反应。结论成功构建了HRSV兰州株F基因片段原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta中获得了表达,表达的重组蛋白具有反应原性和特异性,为HRSV感染引起的疾病血清学诊断以及试剂盒的研发提供了材料。     

玉竹生物活性成分C对小鼠免疫功能的影响

研究玉竹生物活性成分C对小鼠细胞免疫功能的影响,并探讨其作用机制.采用MTT比色法和CFSE检测小鼠淋巴细胞转化情况,流式细胞术检测对αβT和γδT细胞增殖及CD4+ αβT细胞/CD8+αβT细胞比值的影响,ELISA法检测脾细胞培养上清中Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4的分泌水平.结果显示,玉竹生物活性成分C在一定浓度范围内可促进小鼠脾αβT细胞增殖,其中以1 000μg/mL的浓度作用最强.1 000 μg/mL浓度的玉竹生物活性成分C具有降低CD4+ αβT细胞与CD8+ αβT细胞比值,提高CD8+αβT细胞教量的作用.1 000 μg/mL浓度的玉竹生物活性成分C能有效刺激小鼠脾淋巴细胞释放细胞因子IFN-γ,而对IL-4的产生没有明显的影响.本研究为开发玉竹生物活性成分C提供实验依据.     

粗毛栓菌胞外锰过氧化物酶的纯化及性质

培养于麦草粉上的白腐担子菌粗毛栓菌分泌胞外木质纤维素降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶)。经过超滤、盐析、离子交换层析、凝胶过滤和活性聚丙烯酰胺凝胶电泳等步骤,获得了初步纯化的锰过氧化物酶组分。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电点聚焦技术所测定的锰过氧化物酶的相对分子质量和等电点分别为35.7 ku和pI 2.8。研究结果表明,所纯化的锰过氧化物酶在407nm处具有最大光吸收峰,该酶最适作用pH值和温度分别为pH 5.3和35℃。