碱茅(puccinellia tenuifolra)Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达

从碱茅根cDNA文库分离得到Put-Cu/Zn-SOD全长cDNA,其序列全长为2 700 bp,该基因的开放读码框为长615 bp,所编码的蛋白由204个氨基酸组成,其预测分子量约为20.6 kD、理论等电点约为5.63.Put-Cu/Zn-SOD氨基酸序列与水稻Cu/Zn-SOD序列有较高的同源性为87%.将Put-Cu/Zn-SOD基因构建到酵母表达载体pYES2,并转化至酵母(INVSc1).对pYES2-Put-Cu/Zn-SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照(pYES2转化酵母),结果显示了碱茅的Cu/Zn-SOD基因在酵母表达中,具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力.     

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）

PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出的优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。     

基因表达系列分析法(SAGE)的改进及其在植物功能基因组研究中的应用

基因表达系列分析方法(SAGE)是一种新的基因表达分析方法,与基因芯片技术一样具有高通量的特点,可测定特定组织的基因表达水平,在全基因组水平上同时定量检测数万个基因表达模式;可在未知目的基因的前提下,分析来自一个细胞的全部转录本信息;对已知或未知基因表达进行定性和定量分析.目前,虽然在疾病、发育、细胞凋亡、药物筛选等多个领域已有利用SAGE方法进行的研究,但该方法在植物功能基因组研究中的应用相对较少.本文主要综述了该方法在RNA用量、PCR循环次数、SAGE效能和可靠性、标签长度和未知标签分析等方面的改进及其在植物中构建SAGE文库、筛选新基因、基因表达图谱分析等方面的应用,从而为其在植物功能基因组研究中的进一步应用提供理论参考.     

小鼠胎肝细胞透明质酸3D培养体系的建立

目的 利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系。 方法 分离获得胚胎12-14天胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系。 结果 胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长。分离培养获得的肝干/祖细胞克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加。Q-PCR结果显示随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、EpCAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平。 结论 本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞肝细胞功能进一步成熟。     

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。     

与链霉菌发育分化有关的启动子——PTH4的调控研究

依赖于天蓝色链霉菌分化关键基因——whiG的发育调控启动子(P_TH4)所控制的下游基因被克隆了,用双脱氧链终止法进行了双链测序.结果表明在1597bp的DNA片段中含有一个完整的开读框架(ORF).在计算机的蛋白文库比较中未找到与该基因产物同源的已知蛋白,可能是一个新的蛋白产物.用基因破坏的策略初步研究了该基因的生物学功能,发现该基因的破坏影响了放线紫红素的产生,即与天蓝色链霉菌放线紫红素的生物合成有关.这进一步证明启动子——P_TH4在链霉菌分化中的多级调控作用.     

基于小鼠肝细胞癌全转录组测序的Cbx3基因上调表达机制分析

为了探讨染色质盒蛋白3(chromobox 3,Cbx3)基因在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中上调表达的可能机制,通过构建小鼠HCC模型,分别取30 d的瘤体组织和癌旁组织及接种0、3、30 d未成瘤小鼠的肝组织,通过全转录组测序和生物信息学手段分析Cbx3基因在瘤体组织及各对照组织中的表达,并进一步筛选与Cbx3或其编码蛋白有蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)、竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)和靶标关系的差异(q<0.05,n=3,下同)表达基因[以下将Cbx3编码蛋白PPI涉及的蛋白的编码基因称Cbx3相关基因(Cbx3-associated gene, CAG)],并分析其功能。结果显示,与对照组相比,瘤体组织中Cbx3上调表达,且存在4个Cbx3转录本及116个CAG。其中转录本NM＿007624.3尽管在各组织中皆有大量表达,但在瘤体组织的表达远高于各对照组织的。GO功能富集分析结果显示,Cbx3基因及CAG主要存在于细胞核中,共同参...     

水牛ApoB基因多态性与泌乳性状关联分析

本研究旨在探究水牛(Bubalus bubalis)载脂蛋白B基因(ApoB)在地中海水牛群体中的遗传多态性,并与地中海水牛泌乳性状进行关联分析,筛选水牛产奶性状分子标记。本研究以350头地中海纯种奶水牛为研究对象,利用直接测序法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法筛选基因多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)与基因分型,并进一步分析单倍型与泌乳性状的相关性。结果显示,在地中海水牛群体ApoB基因中筛选到10个SNPs,分别位于启动子(g.-1718A>G、g.-1823G>C和g.-2063A>C)、第7内含子(g.8105G>A)、第26内含子(g.30643G>A)、第5外显子(g.5903G>A)、第26外显子(g.30879T>C、g.33638A>C和g.37375G>A)和第29外显子(g.40787A>G)区域。10个SNPs位点多态信息含量均大于0.25且小于0.5,属于中度多态。其中g.-1718A>G、g.-1823G>...     

栗背短脚鹎的种群分化与遗传多样性

栗背短脚鹎(Hemixos castanonotus)是我国南方山区常见的杂食性鸟类。为探明其遗传多样性及分化现状,采用线粒体Cyt b基因和7个核基因非编码区片段作为分子标记,对分布于广东、广西、海南、贵州和江西五省(自治区)的栗背短脚鹎11个地理种群进行了遗传分化及遗传多样性研究。基于所获得的Cyt b基因866 bp和7个核基因内含子序列6 808 bp进行分析。结果显示,在Cyt b基因中,共检测到37个单倍型,共享单倍型占单倍型总数的35.6%,推测这些共享单倍型可能属于祖先单倍型。分子方差分析结果显示,遗传变异主要来源于种群内部(79.77%)。Tajima’s D和Fu’s Fs中性检验分析结果均支持栗背短脚鹎种群可能曾经历过种群扩张现象。基于7个核基因内含子联合序列的贝叶斯天际线(BSP)分析,推断其种群在大约5.3 ~ 3.7百万年前(Mya)和约0.7 ~ 0.3百万年前(Mya)发生过扩张。基于Cyt b基因的贝叶斯系统发育分析,11个地理种群共分为两支,一支为海南猴猕岭地理种群,属指名亚种(H. c. castanonotus),其他10个地理种群聚为另一支,属H. c. canipennis亚种,并且后者尚未形成显著的地理结构,单倍型网络图分析也获得相似的结果。本研究所用分子数据基本支持两个亚种的分化,对于存在争议的广西南部分布的指名亚种,其分子数据与形态学亚种归属不一致,有待更深入研究。     

陆地棉纤维长度和强度的优异位点挖掘及其候选基因预测

纤维长度和强度是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)纤维品质性状中的2个关键性状,其遗传基础的解析对优质棉品种培育具有重要意义.本研究以315个陆地棉品种(系)为关联分析群体,利用混合线性模型(MLM,mixed linear model)对来自5个环境的纤维长度和强度进行全基因组关联分析(GWAS,g...