莱菔子乙醇提取物对ApoE-/-小鼠血脂血糖及肝脂肪变性的影响*

目的:探讨莱菔子乙醇提取物(AERS)对ApoE^-/-小鼠血脂血糖及肝脂肪变性的影响及其机制。方法:随机将60只ApoE^-/-小鼠分为对照组(CG)、生理盐水组(NG)、罗格列酮组(RG)、AERS治疗组,后者再分成AERS低、中、高剂量组(AERS-L/M/H),每组10只。除CG常规饲料外,其他动物均以高脂高糖高盐饲料饲养9周,CG和NG分别每天以等容量NS灌胃1次,RG每天灌胃罗格列酮(1.33 mg·kg^-1,NS稀释成等容量溶液,每次0.2 ml·10 g^-1),AERS组动物每天分别予AERS灌胃(100、300和900 mg·kg^-1)9周后。肝病理学观察,检测FPG、FIns,计算胰岛素抵抗指数(IRI)和肝系数(LC)。检测血清ALT、AST、瘦素(LEP)、TNF-α及血脂水平(TC、FFA等)。Western blot检测肝脂质代谢相关蛋白表达(HMG-R、LDL-R、LEP-R)。结果:与CG相比,NG和RG肝脏外观(色泽、肿胀情况等)和病理学(脂肪变性、肝细胞坏死等)改变明显,而AERS-M/H与CG相似;与CG相比,血清FPG、Fins、IRI、ALT、AST、TNF-α、LC、TG、LDL-C、FFA、LEP等指标明显升高(P＜0.05);与NG相比,AERS呈现剂量依赖性降低(P＜0.05);与RG相比,AERS-H的FPG、Fins明显升高(P＜0.05),而IRI明显降低(P＜0.05);与NG和RG相比,AERS组的HMG-R和LEP-R蛋白表达呈剂量依赖性减少,而LDL-R蛋白表达呈剂量依赖性增加(P＜0.05)。结论:AERS能阻止高脂高糖饲料诱导ApoE^-/^-小鼠血脂血糖升高及肝脂肪变性,其机制与减少FFA和LEP的生成,抑制TNF-α、HMG-R、LEP-R蛋白表达和促进LDL-R的蛋白表达有关。     

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)对猪伪狂犬病毒复制的影响

猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type I interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1^-/-的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度。结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1^-/-细胞活力无影响(P>0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1^-/-中的增殖显著低于PK15细胞(P<0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05);Western Blot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1^-/-的表达显著低于PK15细胞(P<0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代病毒的增殖。以上结果均表明caspase-1基因敲除可抑制PRV在PK15细胞中复制。     

3.0 T磁共振T2×mapping成像技术定量评估膝关节骨性关节炎的临床价值及与WOMAC评分的相关性分析

摘要 目的：研究3.0 T磁共振T2×mapping成像技术定量评估膝关节骨性关节炎（OA）的临床价值及与西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）评分的相关性。方法：将我院于2017年4月～2019年12月期间收治的膝关节OA患者80例纳入研究。根据K-L分级标准将膝关节OA患者分成轻度组（K-L分级为Ⅰ～Ⅱ级）32例,重度组（K-L分级为Ⅲ～Ⅴ级）48例。另取同期于我院进行体检的健康者30例作为对照组。所有受试者均接受3.0 T磁共振T2×mapping扫描,比较各组膝关节不同部位软骨T2值、WOMAC评分以及血清炎症因子水平,以Pearson相关性分析膝关节OA患者膝关节不同部位软骨T2值和WOMAC评分的关系。结果：重度组膝关节不同部位软骨T2值均高于轻度组以及对照组,且轻度组膝关节不同部位软骨T2值均高于对照组（均P＜0.05）。重度组各项WOMAC评分及总分均高于轻度组以及对照组,且轻度组各项WOMAC评分及总分均高于对照组（均P＜0.05）。经Pearson相关性分析发现：膝关节OA患者膝关节不同部位软骨T2值和各项WOMAC评分及总分均呈正相关（均P＜0.05）。重度组血清白介素-1β（IL-1β）、白介素-18（IL-18）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）均高于轻度组以及对照组,且轻度组血清IL-1β、IL-18、TNF-α均高于对照组（均P＜0.05）。结论：3.0 T磁共振T2×mapping成像技术定量评估膝关节OA的临床价值较高,且患者膝关节不同部位软骨T2值与WOMAC评分密切相关。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

酵母杂交系统在CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶率研究中的应用*

目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值。方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率。随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响。首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A、B、C、D、E、F、G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5、pHZ7、pHZ9、pHZ11、pHZ13、pHZ15、pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6、pHZ8、pHZ10、pHZ12、pHZ14、pHZ16、pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20。随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率。结果:酵母培养144~192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低。根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20%,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20%~28%。结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比。sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性。两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值。     

慢性乙肝病毒感染患者肝纤维化、肝功能及Th1/Th2细胞因子水平变化及恩替卡韦干预研究

摘要 目的：研究慢性乙肝病毒（HBV）感染患者肝纤维化、肝功能及Th1/Th2细胞因子水平的变化情况,并分析恩替卡韦干预对慢性HBV感染患者相关指标的影响。方法：选择2016年4月至2018年1月我院收治的120例慢性HBV感染者为研究对象,其中慢性乙肝轻度50例、中度24例、重度21例、肝硬化者25例,并选择同期于我院进行体检的50例健康者为健康对照组,分析不同病情慢性HBV感染患者血清中的肝纤维化指标[透明质酸（HA）、Ⅳ型胶原（ⅣC）,层粘连蛋白（LN）、III型前胶原肽（PC III）]、肝功能指标[丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转移酶（AST）]及Th1/Th2细胞因子[干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）]的变化,慢性HBV感染患者按照随机数字表法分为观察组和对照组,对照组给予还原型谷胱甘肽和复方甘草酸苷等常规护肝治疗,观察组在对照组基础上另口服恩替卡韦分散片治疗,对比两组治疗前后各指标水平。结果：慢性HBV感染患者的肝纤维化指标、肝功能指标及Th1/Th2细胞因子IL-4、IL-6等指标水平均显著高于健康对照组,且随着病情的加重呈逐渐上升趋势;而IFN-γ和IL-2水平均低于健康对照组,随着病情的加重而逐渐降低（P<0.05）。治疗后两组血清肝纤维化指标（HA、ⅣC、LN、PC III）、肝功能指标（ALT、AST）以及IL-4、IL-6水平均显著低于治疗前,且观察组低于对照组（P<0.05）。治疗后两组血清IFN-γ、IL-2水平均高于治疗前,且观察组高于对照组（P<0.05）。结论：慢性HBV感染患者存在肝纤维化水平上升、肝功能受损及Th1/Th2细胞失衡,恩替卡韦联合常规护肝治疗可有效纠正患者的Th1/Th2细胞失衡,减轻患者的肝纤维化,改善其肝功能。     

碱性成纤维细胞生长因子对激光烧伤大兔皮肤愈合的影响分析

摘要 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对激光烧伤大兔皮肤愈合的影响分析。方法：通过热辐射仪激光灼烧对大兔耳朵进行烧伤处理,根据实验需求,将其随机分为三组：对照组,bFGF组,bFGF + DAPT组。通过ImageJ软件测量伤口面积和疤痕组织的厚度,并定期计算残余伤口面积率和疤痕指数。通过组织学分析大兔伤口愈合的新血管生成量。通过蛋白印迹分析Notch1、Jagged1和Hes1的蛋白表达。通过免疫荧光分析愈合后的皮肤中α-SMA,Col I和Col III的相对蛋白水平。结果：bFGF组较对照组的疤痕指数降低（P<0.05）,bFGF+DAPT组较bFGF组疤痕指数升高（P<0.05）。bFGF组较对照组的愈合面积增加（P<0.05）,bFGF + DAPT组较bFGF组愈合面积降低（P<0.05）。与对照组相比,bFGF组的愈合时间明显缩短,较低的残余伤口面积和较低的疤痕指数（P<0.05）,而bFGF + DAPT组表现出明显的愈合延迟和较高的疤痕指数（P<0.05）。bFGF组较对照组的新血管生成量增加（P<0.05）,bFGF + DAPT组较bFGF组心血管生成量减少（P<0.05）。bFGF组较对照组的肉芽组织平均厚度增加,表皮间隙的闭合百分比升高（P<0.05）,bFGF + DAPT组较bFGF组肉芽组织平均厚度增加、表皮间隙的闭合百分比减少（P<0.05）。H＆E染色进行组织学分析发现,与对照组和bFGF + DAPT组相比,bFGF组出现明显的再上皮化和新血管形成,愈合效率较高（P<0.05）。bFGF组较对照组Notch1、Jagged1和Hes1的蛋白表达升高（P<0.05）,bFGF + DAPT组较bFGF组Notch1、Jagged1和Hes1的蛋白表达降低（P<0.05）。bFGF组较对照组?琢-SMA,Col I和Col III的蛋白表达降低（P<0.05）,bFGF + DAPT组较bFGF组表达升高（P<0.05）。结论：bFGF可以通过促进ESC的增殖并通过激活Notch1 / Jagged1途径抑制其向肌成纤维细胞（Myofibroblasts,MFB）的分化加快伤口愈合,减少疤痕形成。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥BRI1突变体的鉴定

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)油菜素内酯受体BRI1为目的基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向编辑拟南芥BRI1,以期获得更多BRI1的突变体,为后续BRI1功能的进一步深入研究奠定基础。通过筛选转基因植株,对编辑后的BRI1进行测序分析,结果显示该突变体中BRI1基因序列由于新碱基的插入导致提前终止。同BRI1强突变体bri1-710一样,相比于野生型对照均对BL处理不敏感,但相比于bri1-710,该突变体植株较大,暗示BRI1 N端可能在BR信号途径中有重要作用。因此该研究可为后续进一步研究拟南芥及其他同源物种的BRI1功能提供可靠的参考依据。     

肿瘤坏死因子α刺激基因/诱导蛋白-6的抗炎作用研究进展

炎症损伤是众多临床疾病的病理学基础,常可引起严重并发症甚至导致死亡。然而传统临床治疗不仅方法有限,且效果不佳。近年研究报道,肿瘤坏死因子α刺激基因/诱导蛋白-6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene/inducible protein 6, TSG-6)可通过与体内相应的配体结合参与炎症反应的多个过程,并发挥抗炎和促进细胞外基质重塑等重要作用。本文就TSG-6的生物学特性、作用机制及其在病理性瘢痕、神经炎症、动脉粥样硬化和关节炎等多种疾病中发挥的抗炎作用作一综述。