限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺

目前有关限制性内切酶NotⅠ的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化NotⅠ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在。为探索限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺,从豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidis-caviarum)中克隆出限制性内切酶NotⅠ的基因并使之在大肠杆菌中高效表达。首先将由成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)中克隆所得甲基化酶EagⅠM(EagⅠ methylase gene)基因连接到pBR322载体上,转化大肠杆菌ER2566,将豚鼠耳炎诺卡菌中克隆所得的限制性内切酶NotⅠR(NotⅠrestriction endonuclease gene)基因连接到表达载体pACYC184-PT₇上,将此重组质粒转化到上述已转入甲基化重组质粒pBR322-EagⅠM的ER2566中,构建成NotⅠ蛋白表达菌ER2566 。重组工程菌经IPTG诱导可表达限制性内切酶NotⅠ,并对诱导条件进行优化使之以可溶形式高效表达。应用KTA purifier 100蛋白纯化系统,对纯化工艺进行创新,通过DEAE Sephrose FF离子交换层析、phenyl HP疏水层析和Superdex 75 10/300 GL分子筛层析对蛋白进行提纯。纯化后NotⅠ经酶活力及纯度鉴定,其比活力为1.37×10⁶U/mg,提纯35倍,得率为17.8％,产量达9.8×10⁶ Units /g wet cell,提纯时间缩减为原来的1/10,在产量和效率上较以前报道均有很大提高。该纯化工艺的新方法,为实验室制备及工业化生产Ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。且该酶的成功获得为后续研究提供了材料,为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考。     

荧光光谱法研究淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ与牛血清白蛋白的相互作用

在模拟生理条件下应用荧光光谱学方法分别研究了淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ与牛血清白蛋白（BSA）间的结合作用. 根据荧光强度数据,计算出了结合常数KA,结合位点数n和热力学参数（△G, △H 和△S）. 实验结果表明,淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ都能显著猝灭BSA的内源荧光,猝灭机制均为形成基态复合物的单一静态猝灭过程. 不同温度下（17 ℃, 27 ℃, 37 ℃）得到的KA和n值,表明淫羊藿次苷Ⅰ与BSA的结合强于淫羊藿苷. 从得到的热力学参数判断,淫羊藿苷与BSA间的主要作用力是氢键作用和范德华力,而疏水作用和静电引力在淫羊藿次苷Ⅰ与BSA形成复合物过程中起主导作用.而且同步荧光光谱显示,淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ与BSA的结合导致BSA构象发生了变化.     

青杄PSAK的克隆及生物信息学分析

目的:获取青杄的PSAK全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并鉴定其在青杄各组织中相对表达量。方法:以多年生青杄(Picea wilsonii)的cDNA文库为模板,通过RACE PCR的方法获取PSAK的末端序列,经过与EST序列拼接得到PSAK基因的cDNA全长序列。通过特异引物将其克隆在pEASY-T1载体上,基于其氨基酸序列,利用DNAMAN、ExPASy、SWISS-MODEL等工具对其进行生物信息学分析,进行了半定量RT-PCR与RT-qPCR实验来检测其在mRNA水平的组织表达情况。结果:青杄PSAK基因编码140个氨基酸,蛋白分子量为14.23kDa,理论等电点为10.29。蛋白的C端有较为保守的结构域,与拟南芥、烟草等物种具有较高的相似性。PwPSAK主要在青杄的针叶与茎中进行表达。结论:成功获取了PwPSAK的单克隆并进行了生物信息学分析,为青杄中PSAK后续的功能研究提供理论依据。     

环氧苍耳素Ⅰ对菜青虫中肠消化酶和羧酸酯酶活性的影响

【目的】探明苍耳Xanthium sibiricum活性物质--环氧苍耳素Ⅰ对菜青虫的作用机理。【方法】采用饲喂法处理4龄菜青虫Pieris rapae, 测试从苍耳中分离提纯的环氧苍耳素Ⅰ（为倍半萜内酯类物质）对菜青虫中肠蛋白酶、 淀粉酶和羧酸酯酶活性的影响。【结果】环氧苍耳素Ⅰ对蛋白酶活性的抑制最强, 处理后12, 24和48 h, 菜青虫中肠蛋白酶抑制率分别为20.95%,29.38%和50.06%; 其次为淀粉酶, 抑制率分别为11.89%,39.01%和31.92%。同时,中肠羧酸酯酶活性在处理后12 h与对照之间无显著变化, 24 h 时活性被显著抑制, 而48 h时活性却明显高于对照。【结论】环氧苍耳素Ⅰ对昆虫中肠消化酶活性的抑制, 可能是引起昆虫表现取食抑制和生长发育不良的重要原因之一。     

DNA条形码技术在田间常见蓟马种类识别中的应用

蓟马类害虫种类多、 体型小, 传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。本研究利用DNA条形码通用型引物, 以我国田间常见的25种蓟马为靶标扩增其线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ gene, mtDNA COⅠ) 基因 (约650 bp), 通过对靶标片段碱基序列的测序及比对分析, 以邻接法 (NJ法) 构建系统发育树, 并以Kimura双参数模型计算种内、 种间遗传距离。结果表明： 聚类分析与形态学鉴定结果一致, 表现为较长的种间分支和较短的种内分支, 每个单系分支对应一个物种, 同一物种不同单倍型的最初分支自展值均为100%。25种蓟马的种内平均遗传距离为0.0027, 种间平均遗传距离为0.2757, 种间遗传距离为种内遗传距离的102.1倍; 而且种内、 种间遗传距离没有重叠区域。结果说明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴别。     

基于mtDNA COⅠ基因序列的云南榕母管蓟马不同地理种群的遗传分化分析

榕母管蓟马Gynaikothrips ficorum （Marchal）是一种已扩散至各大洲的榕树主要害虫, 目前在云南省热带及亚热带区域发生危害亦较为严重。为了揭示榕母管蓟马在云南省不同地理种群间的遗传变异, 测定了10个地理种群145个个体的mtDNA COⅠ基因的646 bp序列, 对地理种群间的序列变异和遗传分化进行了分析。结果表明： 10个地理种群间的COⅠ基因共有38个变异位点和6个单倍型, 其中1个单倍型为8个种群所共享。种群间的遗传距离范围为0~0.043, 其中瑞丽、 芒市、 玉溪、 呈贡种群间的遗传距离最小, 宜良和陇川、 墨江种群间的遗传距离最大, 种群遗传距离大小与其相对地理距离的远近之间没有相关性。分子方差分析显示3组（组1： 陇川、 瑞丽、 芒市、 玉溪、 呈贡、 墨江、 临沧、 勐腊8个种群; 组2： 蒙自种群; 组3： 宜良种群）之间已经具有明显的遗传分化, Fst值为0.9828（P<0.05）, Nm值为0.01, 但是仅0.0172的遗传变异来自组内。采用邻接法（NJ）构建分子系统树, 单倍型被分成3组与各自的地理区域相对应的簇群, 各组之间未发现共享的单倍型。分子系统树显示3组的聚类结果与地理分布格局并不对应。综合采集地寄主植物的状况, 初步推测蒙自和宜良种群出现的遗传分化可能是由于寄主植物生长状况及品种不同引起的。各地理种群中的单倍型在网络中介图上散布在不同的分布群中, 缺乏明显的地理分布格局。     

DNA模式识别受体研究进展

固有免疫系统利用模式识别受体识别病原相关分子模式。近期研究发现,外源DNA能够被宿主细胞中多种DNA受体识别,激活多种信号通路,上调Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子的表达。基于DNA的免疫识别在激活宿主抗感染免疫过程中起重要作用,因此仅对现已报道的DNA受体进行概述,同时对DNA的免疫识别与自身免疫病之间的关系进行探讨。     

尖毛虫属Actin Ⅰ、α-TBP和DNA pol α乱序基因的模式研究

研究旨在对尖毛虫属内现有物种的3种乱序小核基因结构进行比较,探讨其乱序模式。于湛江湖光红树林水域中采集到一个尖毛虫属物种Oxytricha sp.（ZJ）,成功扩增了其肌动蛋白Ⅰ（ActinⅠ）、端粒结合蛋白（α-TBP）、DNA聚合酶α（DNA pol α）3个乱序基因的完整大核基因序列和完整/部分小核基因序列,并结合已有资料对比研究了尖毛虫属这3个乱序基因的进化。结果表明:（1）Oxytricha sp.（ZJ）与O.nova的小核Actin Ⅰ基因具有相同的乱序模式,区别于其余的尖毛虫属物种;在增加尖毛虫属物种的基础上,对前人推测提出了质疑,我们认为MDS-IES接合处移动现象在乱序MDSs之间并非比非乱序MDSs之间更保守。（2）Oxytricha sp.（ZJ）与O.nova的小核α-TBP基因具有相同乱序模式和相似长度的IESs。（3）Oxytricha sp.（ZJ）的小核DNA pol α基因乱序模式,区别于任一已报道物种,与属内O. trifallax最为相近。基于序列分析,在DNA pol α基因中发现了一例IES转换为MDS的痕迹,以及由此导致原先MDS的丢失。研究发现在编码区内IES向MDS的转变,使得本应删除的序列成为基因组永久保留的一部分。     

一个由HSVⅠ诱导的类SR蛋白新基因的克隆

 根据mRNA差异显示分析 ,由单纯疱疹病毒 (HSV)Ⅰ型结合人成纤维细胞膜受体后 2h诱导产生的早期基因cDNA库中 ,分离到一个编码具有SR蛋白结构特征的新基因 ,该基因长 90 4bp .编码产生的蛋白含 12 1个氨基酸残基 ,分子量 14 9kD ,具有RS重复区和PPLP结构域 ,但不具备SR蛋白家族所特有的RNA识别区域 (RRM) .主要分布于细胞质内 ,仅在细胞膜相应受体与HSVⅠ结合后特异产生     

水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的水貂肠炎病毒(MEV)VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物,经PCR扩增出146bp的目的片段,并克隆到pMD 18-T载体上,提取重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品,绘制荧光定量标准曲线,以此建立一种基于SYBR Green荧光染料的定量PCR特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明:该方法对MEV有很好的特异性,检测灵敏度为34拷贝/μL,且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中,在80份样品中检测到30份阳性样品,高于普通PCR和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析,为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。