KRT71决定羊驼毛弯曲度的形成

角蛋白71（Keratins 71,KRT71）属于人类Ⅱ型上皮角蛋白,是毛囊特异性的上皮角蛋白基因。相关研究表明,在其他物种中,KRT71与被毛卷曲相关,KRT71在卷曲的被毛形成过程中起着重要的作用。现眼观羊驼背部、耳部和腿部毛发的弯曲程度不同,但KRT71与其被毛的弯曲度是否相关尚不清楚。本研究利用PCR技术克隆KRT71基因全CDS区。通过实时荧光定量PCR技术检测基因的表达。免疫组化、Western 印迹对KRT71蛋白在羊驼背部、耳部和腿部皮肤组织中的表达量进行分析,以探讨KRT71与羊驼毛发弯曲度的关系。结果显示,羊驼的KRT71基因的CDS区共有1 578 bp,编码525个氨基酸;免疫组化结果显示,KRT71在羊驼的背部、耳部和腿部均有表达,并且主要特异性表达于毛囊的内根鞘;实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示,KRT71的mRNA和蛋白量均呈现背部﹥腿部﹥耳部的趋势;相较于耳部,背部和腿部的表达量较高。实验结果提示,KRT71的表达量与毛纤维的弯曲度呈正相关,KRT71可能在羊驼毛纤维的弯曲度形成过程中发挥着一定的作用。     

蒜头果中CYP71基因克隆与果实不同发育时期的表达分析

由氨基酸衍生的氰苷是由植物细胞色素P450单加氧酶(CYP)催化氨基酸生成的次生代谢产物,与植物的防御和抗逆境胁迫相关。该研究通过分析蒜头果转录组数据,从中分离并克隆得到1条细胞色素P450基因(命名为MoCYP71,GenBank登录号为MK172858),对其进行生物信息学分析并检测该基因在果实不同发育时期的表达情况。结果表明:MoCYP71基因含1 572 bp,编码523个氨基酸,该基因的cDNA序列与咖啡(Coffea eugenioides,XM_027319282)、小果咖啡(Coffea arabica,XM_027213456)中的CYP71基因的mRNA序列均有88%的一致性; MoCYP71蛋白的相对分子质量为58 976.54,理论等电点pI为8.10,分子式为C_(2675)H_(4184)N_(704)O_(744)S_(27),不稳定系数(Ⅱ)为40.84,是一种不稳定蛋白;该蛋白不存在信号肽,存在于分泌途径,含有两个跨膜结构,分别位于20～37和311～333位的氨基酸为跨膜疏水螺旋,锚定于细胞器上;该蛋白含有CYP家族的保守结构域,包括脯氨酸富集区(PPSPPRLP)、K螺旋(KETFR)、I螺旋(GGIDTS)、PERF域(PERF)和识别结构域血红素结合域(FGAGRRICPG),与可可、榴莲、高粱等的CYP71E家族的蛋白(GenBank登录号分别为EOX92908.1、XP_022773875.1和AAC39318.1)聚为一支;在花谢后,MoCYP71基因表达量逐渐降低,花谢后1个月2个月3个月,但在花谢后4个月的表达量急剧增加。以上结果对研究蒜头果的对虫害的防御、组织成熟及蒜头果中有效次生代谢产物的发掘具有重要意义。     

The highly conserved 5' untranslated region as an effective target towards the inhibition of Enterovirus 71 replication by unmodified and appropriate 2'-modified siRNAs

Background

Cryptococcus neoformans has a predilection for central nervous system infection. C. neoformans traversal of the blood brain barrier, composed of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC), is the crucial step in brain infection. However, the molecular mechanism of the interaction between Cryptococcus neoformans and HBMEC, relevant to its brain invasion, is still largely unknown.

Methods

In this report, we explored several cellular and molecular events involving the membrane lipid rafts and caveolin-1 (Cav1) of HBMEC during C. neoformans infection. Immunofluorescence microscopy was used to examine the roles of Cav1. The knockdown of Cav1 by the siRNA treatment was performed. Phosphorylation of Cav1 relevant to its invasion functions was investigated.

Results

We found that the host receptor CD44 colocalized with Cav1 on the plasma membrane, and knockdown of Cav1 significantly reduced the fungal ability to invade HBMEC. Although the CD44 molecules were still present, HBMEC membrane organization was distorted by Cav1 knockdown. Concomitantly, knockdown of Cav1 significantly reduced the fungal crossing of the HBMEC monolayer in vitro. Upon C. neoformans engagement, host Cav1 was phosphorylated in a CD44-dependent manner. This phosphorylation was diminished by filipin, a disrupter of lipid raft structure. Furthermore, the phosphorylated Cav1 at the lipid raft migrated inward to the perinuclear localization. Interestingly, the phospho-Cav1 formed a thread-like structure and colocalized with actin filaments but not with the microtubule network.

Conclusion

These data support that C. neoformans internalization into HBMEC is a lipid raft/caveolae-dependent endocytic process where the actin cytoskeleton is involved, and the Cav1 plays an essential role in C. neoformans traversal of the blood-brain barrier.     

肠道病毒71型2A蛋白的研究进展

肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)是手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)主要致病原之一。手足口病临床上常表现为发热,手掌、脚掌及口腔黏膜皮疹或疱疹。然而,EV71感染导致的手足口病易伴随神经系统并发症,甚至死亡。EV71非结构蛋白2A作为蛋白酶和转录激活因子,在EV71生命周期中发挥重要作用。本文对2A的结构与功能研究进展进行综述,揭示2A的双重功能如何促进病毒复制和调控靶细胞,为进一步研究靶向2A的抗病毒疫苗和药物提供理论基础。     

杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

肠道病毒71型疫苗的研究进展

近年来,手足口病(Hand foot mouth disease,HFMD)在中国多次爆发流行,严重威胁公众健康,尤其是5岁以下的婴幼儿。而肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起手足口病的主要病原体之一,由于目前还无针对该疾病有效的抗病毒药物,研制疫苗是控制EV71流行最为有效的措施。目前EV71疫苗及相关研究均取得重大突破,本文就近年来关于EV71疫苗研发、动物模型等的研究进展作一综述。     

肠道病毒71型感染诱导细胞程序性死亡形态学及分子生物学特征的初步研究

肠道病毒 71型(enterovirus type 71,EV71)感染常可引起婴幼儿手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD),还可引起中枢神经系统并发症等重症,甚至死亡。研究认为,EV71诱发重症的原因主要与病毒感染诱导细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)及诱导细胞产生大量炎症因子有关。病毒感染可通过激活不同的信号通路触发细胞程序性死亡,主要包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)依赖的细胞凋亡、细胞焦亡,以及非caspase依赖的细胞坏死性凋亡。本研究旨在探讨EV71感染诱导细胞程序性死亡的形态学和分子生物学特征,利用显微镜和免疫荧光技术检测EV71感染后细胞形态变化,JC-1染色检测感染后细胞线粒体膜电位变化,流式细胞术及Annexin V-FITC/PI双染法、乳酸脱氢酶释放量法检测感染细胞的细胞膜损伤程度,结合蛋白免疫印迹法检测病毒感染后细胞中多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]、caspase-9、caspase-3等凋亡因子,以及细胞焦亡关键效应蛋白Gasdermin D、坏死性凋亡效应蛋白MLKL的磷酸化情况。结果显示,EV71感染后细胞主要呈现凋亡特征,并伴随少量细胞坏死。与细胞凋亡相关的PARP被剪切,caspase-9和caspase-3等相关因子被激活。经泛caspase抑制剂处理后,细胞程序性死亡被抑制,但仍有部分细胞坏死。结果提示,EV71感染以细胞凋亡为主,也可能存在非caspase依赖的细胞程序性死亡。     

EV71诱导人神经细胞SH-SY5Y自噬的分子机制

【背景】EV71感染所致的重症手足口病易导致神经系统并发症,使患儿预后较差,甚至死亡。【目的】从EV71可诱导神经细胞自噬这一现象出发,探索该病毒诱导神经细胞自噬的miRNA机制,探讨EV71损伤神经细胞可能的分子机制。【方法】通过RT-PCR及Westernblot技术,在感染EV71病毒的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中检测细胞自噬变化;通过芯片分析细胞感染前后差异表达的miRNA分子,再使用miRNA mimics调节工具明确与EV71诱导神经细胞自噬有关的miRNA分子。【结果】EV71可诱导SH-SY5Y细胞自噬增加,下调细胞内miRNA29b(miR29b)分子的表达水平;当上调细胞内miR29b的表达后,EV71诱导细胞自噬增加的现象可被逆转,病毒复制水平下降。【结论】EV71诱导神经细胞自噬是通过下调miR29b分子的表达水平实现;miR29b不仅与自噬相关,它与EV71病毒复制也存在密切关系。因此,该研究不仅有助于阐明EV71导致神经系统损伤的具体分子机制,还为miR29b成为治疗EV71感染可能的新药物靶点奠定了理论基础。