蛋白质组学技术在布鲁氏菌病研究中的应用及发展

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的重大人畜共患病之一,给我国养殖业发展和公共安全带来严重危害。有效控制和逐步消灭布鲁氏菌病对于公共卫生安全和养殖业的发展具有重要意义。然而,由于布鲁氏菌为胞内寄生菌且结构复杂,其致病机制和相关毒力因子仍不十分清楚;加之我国现有的布鲁氏菌疫苗均为光滑型疫苗,其诱导产生的抗体与自然感染在临床诊断上存在着干扰,给种群净化带来严重困难。虽然已有许多研究通过多种技术尝试解决上述问题,但进展多较为缓慢。蛋白质组学作为研究蛋白质组成和变化规律的新兴学科,随着其研究手段的逐步发展和完善,通过蛋白质组学的手段揭示布鲁氏菌的致病机理、免疫机制等的研究逐渐增多,对于解决布鲁氏菌带来的上述问题提供了崭新的思路。本文结合实验室自身研究,主要从蛋白质组学对布鲁氏菌特异性蛋白的挖掘和对鉴别诊断的意义等方面做一简要阐述。     

盐芥叶片响应干旱胁迫的蛋白质组学初步分析

盐芥是新兴起的植物非生物逆境研究模式植物,研究盐芥叶片蛋白质组对于干旱胁迫的响应,以推进对植物干旱耐受机制的认识。该研究应用双向电泳技术分析了干旱胁迫对于盐芥叶片蛋白质组的影响,结果共鉴定了63个干旱胁迫差异表达蛋白,包括丰度上调的31个,新出现的蛋白点14个,丰度下调的15个,消失的蛋白点3个。应用生物质谱分析技术确定了包括硫氧还蛋白,铁蛋白-1和凝集素在内的9个干旱胁迫响应蛋白的身份,对这些干旱胁迫响应蛋白的功能分类分析表明,盐芥的耐旱机制可能涉及自由基清除能力的增强、能量代谢的调整以及光合作用的维持。     

蛋白质组学进展

在蛋白质水平上定量、动态、整体性研究生物体的蛋白质组学 ,将在后基因组时代大大增进我们对基因功能的理解。简要介绍了蛋白质组学的概念、研究手段 ,及最新进展     

胃癌细胞高尔基体的蛋白质组学技术平台的建立

采用蔗糖密度梯度超速离心法分离纯化高尔基体,双向凝胶电泳（2-DE）分离高尔基体蛋白质,用ImageMaster 2D软件分析所得图谱,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。结果显示分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱,运用质谱技术鉴定出12个蛋白质,包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白、细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化,双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析,首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线,为胃癌细胞内高尔基体功能的深入研究奠定了基础。     

尿蛋白质组学在肾脏疾病研究中的应用

长期以来,肾脏病的治疗进展一直十分缓慢,这是因为目前一些肾脏病在诊断分型上存在很多缺陷,分型通常只能依靠细微的组织病理学差异,这使早期诊断、预后追踪以及疗效观察都十分困难。如果能发现像肌钙蛋白一样特异的生物学标志物,将有助于提高肾脏病的诊疗水平。由于尿液与泌尿系统之间存在着天然的联系,这使得尿液在反映泌尿系统功能方面具备"地理"优势。因此,尿蛋白质组学的兴起和发展为肾脏病及其他泌尿系统疾病的研究开启了一扇新的大门。该文综述了尿蛋白质组学技术的发展及其在各种泌尿系统疾病研究中的应用。     

华根霉固态与液态培养产胞外蛋白的比较蛋白质组学分析

【目的】考察固态和液态两种培养方式对丝状真菌华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021产胞外蛋白的影响,以加深对微生物固、液态培养特异性产酶的认识。【方法】利用成分相同的培养基对华根霉分别进行平板固态培养和液态培养,提取华根霉所产胞外蛋白,采用二维凝胶电泳(2-DE)结合质谱分析,分离鉴定差异蛋白。【结果】固态培养下华根霉所产胞外蛋白的蛋白酶活性是液态培养的9.2倍。胞外蛋白质组数据分析表明,华根霉固态和液态培养所产胞外蛋白存在显著差异,其中约70%是固态和液态培养下各自产生的特有蛋白。质谱鉴定进一步表明,固、液态培养对华根霉产胞外蛋白的种类和表达量都有显著影响,其中水解酶类所占比例较大,主要是与蛋白质降解相关的蛋白。【结论】固态和液态不同培养方式影响了华根霉产胞外蛋白的组成,有些基因只在特定培养方式下表达。固态培养下华根霉产胞外蛋白酶种类相对更多以及大部分蛋白酶的上调表达,可能是固态培养下胞外蛋白酶活性很高的原因。研究结果提示需要注意固液态不同培养方式下丝状真菌胞外酶的筛选和生产可能存在的不一致性。     

小峰熊蜂蜂王蛹期发育蛋白质组分析

为了探明小峰熊蜂Bombus hypocrita蜂王蛹期发育蛋白质表达调控方面的特点,揭示其发育的分子机理。采用双向电泳法对小峰熊蜂蜂王蛹期发育进行蛋白质组研究,结果在小峰熊蜂蜂王蛹期的白眼期(A期)、褐眼期(B期)和黑眼期(C期)分别检测到81、80和75个蛋白点,特有蛋白质分别为8个、7个和2个,共有蛋白质为61个,A期到B期有4个蛋白质显著上调,5个显著下调,B期到C期有7个蛋白质显著上调,1个显著下调,A期到C期有10个蛋白质显著上调,有4个显著下调。此外,3个蛋白质是在A、B期表达C期关闭,6个蛋白质A、C期表达,B期关闭,5个蛋白质A期关闭,而B、C期表达。初步表明小峰熊蜂蜂王从蛹期发育到成蜂过程中,不仅需要一些保守蛋白质来调控,而且还需要一些特异蛋白质。     

High throughput protein characterization by automated reverse-phase chromatography/electrospray tandem mass spectrometry.

We describe an integrated workstation for the automated, high-throughput, and conclusive identification of proteins by reverse-phase chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. The instrumentation consists of a refrigerated autosampler, a submicrobore reverse-phase liquid chromatograph, and an electrospray triple quadrupole mass spectrometer. For protein identification, enzymatic digests of either homogeneous polypeptides or simple protein mixtures were generated and loaded into the autosampler. Samples were sequentially injected every 32 min. Ions of eluting peptides were automatically selected by the mass spectrometer and subjected to collision-induced dissociation. Following each run, the resulting tandem mass spectra were automatically analyzed by SEQUEST, a program that correlates uninterpreted peptide fragmentation patterns with amino acid sequences contained in databases. Protein identification was established by SEQUEST_SUMMARY a program that combines the SEQUEST scores of peptides originating from the same protein and ranks the cumulative results in a short summary. The workstation's performance was demonstrated by the unattended identification of 90 proteins from the yeast Saccharomyces cerevisiae, which were separated by high-resolution two-dimensional PAGE. The system was found to be very robust and identification was reliably and conclusively established for proteins if quantities exceeding 1-5 pmol were applied to the gel. The level of automation, the throughput, and the reliability of the results suggest that this system will be useful for the many projects that require the characterization of large numbers of proteins.     

Electrospray-ionization mass spectrometry of intact intrinsic membrane proteins.

Membrane proteins drive and mediate many essential cellular processes making them a vital section of the proteome. However, the amphipathic nature of these molecules ensures their detailed structural analysis remains challenging. A versatile procedure for effective electrospray-ionization mass spectrometry (ESI-MS) of intact intrinsic membrane proteins purified using reverse-phase chromatography in aqueous formic acid/isopropanol is presented. The spectra of four examples, bacteriorhodopsin and its apoprotein from Halobacterium and the D1 and D2 reaction-center subunits from spinach thylakoids, achieve mass measurements that are within 0.01% of calculated theoretical values. All of the spectra reveal lesser quantities of other molecular species that can usually be equated with covalently modified subpopulations of these proteins. Our analysis of bovine rhodopsin, the first ESI-MS study of a G-protein coupled receptor, yielded a complex spectrum indicative of extensive molecular heterogeneity. The range of masses measured for the native molecule agrees well with the range calculated based upon variable glycosylation and reveals further heterogeneity arising from other covalent modifications. The technique described represents the most precise way to catalogue membrane proteins and their post-translational modifications. Resolution of the components of protein complexes provides insights into native protein/protein interactions. The apparent retention of structure by bacteriorhodopsin during the analysis raises the potential of obtaining tertiary structure information using more developed ESI-MS experiments.     

人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析

采用以肿瘤免疫学与蛋白质组学(proteomics)研究技术有机地结合为基础的血清蛋白质组学研究体系(serologicproteomeanalysis ,SERPA)筛选肺癌分子标志物.对10例人肺鳞癌组织,应用双向凝胶电泳(two dimensionalelectrophoresis ,2 DE)技术对同一肺鳞癌组织的细胞总蛋白同时进行电泳后获得3张相同的凝胶,其中一块2 DE凝胶经银染显色作为平行胶,其余两块2 DE凝胶经电转膜将凝胶中的蛋白质转至硝酸纤维素(NC)膜上,然后分别与肺癌患者的自身血清以及正常对照血清进行Western印迹分析,获取Western印迹反应图谱.经计算机图像分析识别差异反应的蛋白质,然后与平行胶比较找出相应的差异反应蛋白质点.获得了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常对照血清的Western印迹反应图谱;图像分析共识别36±8个差异反应的蛋白质;在平行胶上找到了匹配的差异反应蛋白质点.对2 0个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析,鉴定出14个与细胞生长增殖、细胞代谢、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关抗原.通过血清蛋白质组技术对肺鳞癌组织进行的研究,建立了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常血清的Western印迹反应图谱,成功鉴定14个肺鳞癌相关抗原,为进一步筛选用于肺鳞癌诊断、治疗和预后评估