与细胞周期G2/M期进程相关的H2AX磷酸化

γH2AX焦点(foci)被普遍当做DNA双链断裂（DSB）损伤的分子标志物.为探 讨细胞周期进程相关的H2AX磷酸化规律特征,采用胸腺嘧啶双阻滞结合噻氨酯哒唑(nocodazole)的后续处理,将HeLa细胞同步于有丝分裂的前中期．然后,用流式细胞仪检测细胞周期、Western印迹和免疫荧光法,观察γH2AX表达和γH2AX焦点的形成．结果显示,细胞进入G2/M期和有丝分裂过程中,γH2AX水平显著增加 ;在无DNA DSB发生的情况下,部分M期细胞中也存在大量的γH2AX焦点．随着细 胞完成有丝分裂从M期退出再进入G1期,γH2AX的表达水平逐渐降低．这种 γH2AX表达变化特征与G2/M期密切关联的PLK1和Cyclin B1的表达规律相类似． 在4 Gy大剂量照射下,HeLa细胞于照后8 到12 h出现明显的G2/M期阻滞．γH2AX 焦点数在照后1 h达高峰,随后降低,照后8 h又上升,出现了第2个峰值．与之不同的是,在1 Gy低剂量照射下,细胞的G2/M期阻滞微弱,γH2AX焦点数在照后 0.5 h最高,随后下降,且无反弹,符合DNA DSB的修复动力学特征．因此,将γ H2AX当做DNA DSB分子标志物时,还需要考虑细胞周期变化的影响．γH2AX适合 作为1 Gy以下照射的DNA双链断裂损伤的分子标志．     

H9N2禽流感病毒M2 DNA疫苗初免-蛋白加强免疫的保护效果研究

流感病毒M2(基质蛋白2)是A型流感病毒的一个高度保守的蛋白。由于其免疫原性较弱,本研究采用M2 DNA疫苗初免-蛋白加强的策略来考察M2的免疫保护效果。制备A/Chicken/Jiangsu/07/2002(H9N2)流感病毒的M2 DNA疫苗以及经大肠杆菌表达的去除M2跨膜区的M2蛋白即sM2。以SPF级BALB/c小鼠为模型,电击法免疫M2 DNA疫苗,滴鼻法免疫sM2蛋白,免疫间隔三周,并于末次免疫后三周以致死量5LD50流感病毒H9N2攻击小鼠,通过检测小鼠存活率、体重丢失率、肺部病毒滴度及IgG抗体水平等指标来评价免疫的保护效果。实验结果表明,基于M2的疫苗采用DNA疫苗初免蛋白加强免疫二次的免疫程序能诱导较高的特异性抗体,明显减轻小鼠流感病症,提供完全的保护。     

HIV gag基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响

目的:了解gag基因修饰前后在不同载体系统中的表达水平差异对免疫效果的影响,为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Gag靶抗原奠定实验基础。方法:将含有优化前后gag基因的HIV-1 DNA(pVRC)疫苗和重组痘苗病毒(rVV)载体疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,利用IFN-γ酶联免疫斑点法和胞内细胞因子染色检测各组的细胞免疫效果,ELISA检测体液免疫水平,分别比较基因优化前后及在不同载体内的Gag诱发的免疫效果。结果:DNA疫苗中gag基因修饰后细胞免疫反应由472提高至925 SFC/106MNC,抗体滴度随免疫次数增加而提高,基因修饰后第二针的抗体水平由104.2提高至105.3,三针后则没有差别;而以rVV为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应(~320 SFC/106MNC)和抗体水平(~104.4)均没有差异。2种疫苗联合免疫均可显著提高Gag修饰前后在小鼠体内的免疫效果,基因修饰后细胞免疫反应由1700提高至2100 SFC/106MNC,抗体水平则没有差别。结论:gag基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果,并可进一步提高联合免疫效果,但对rVV疫苗单独免疫效果无明显影响。     

MGMT 甲基化影响替莫唑胺对胶质母细胞瘤疗效的研究

目的:探讨MGMT甲基化如何影响替莫唑胺对胶质母细胞瘤的治疗效果。方法:选取41个胶质母细胞瘤患者(根据相同替莫唑胺化疗方案治疗下临床结局的不同分为两组)的肿瘤组织,采用甲基化特异性聚合酶链反应分析胶质瘤组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态,同时采用免疫组织化学法分析胶质瘤组织中MGMT蛋白表达情况。结果:临床结局不佳组中,以MGMT蛋白表达阳性的肿瘤为主(72.2%),而在结局相对良好组中,MGMT蛋白表达的阳性率仅为39.1%;在MGMT蛋白表达阳性的22例胶质母细胞瘤组织中,7例MGMT启动子甲基化,阳性率为31.8%,在MGMGT蛋白表达阴性的19例中,14例MGMT启动子甲基化,阳性率为73.7%(P<0.05)。结论:MGMT基因启动子区的甲基化状态与MGMT蛋白的表达相关。MGMT基因启动子过甲基化,MGMT蛋白表达较低;MGMT基因启动子去甲基化,MGMT蛋白表达较高。MGMT启动子过甲基化通过抑制MGMT基因的表达而增加替莫唑胺的疗效。     

组织多普勒成像对射血分数正常的心衰患者左心功能评价

目的:探讨组织多普勒成像(TDI)技术评价射血分数正常的心衰患者左室长轴功能特点。方法:选取30名健康人(Ⅰ组)、EF>50%的心衰患者30名(Ⅱ组)和EF<50%的心衰患者30名(Ⅲ组)作为研究对象,采用TDI在二尖瓣环室间隔(ivs)、侧壁(l)、前壁(a)、后壁(p)、下壁(d)测量其Sm、DSm、IVCTm、TSm、Em、Am、IVRTm、TEm等指标。结果:Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组DSm、Sm逐渐减低,(P<0.05);而IVCTm、TSm逐渐升高(P<0.05);IVRTm、TEm在Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅱ组逐渐升高(P<0.05);DSm及TEm在诊断EF>50%心衰患者心功能的指标中ROC曲线下面积最大,同样DSp及TEp在五个位点中ROC曲线下面积最大。结论:射血分数正常的心衰患者存在收缩减低;DSm及TEm是诊断EF>50%心衰患者心功能比较有效的指标;后壁是诊断的最佳位点。     

血小板来源的生长因子通过ERK/p38/PI3K促进人视网膜色素上皮细胞的增殖、迁移

目的:探讨血小板来源的生长因子(PDGF)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖和迁移的影响,并对参与其中的信号通路做初步研究.方法:体外培养的人视网膜色素上皮细胞与含有重组人血小板来源的生长因子的培养基(含有或不含2％(v/v)胎牛血清)共培养,用MTT法检测PDGF对RPE细胞增殖的影响,利用细胞爬片和免疫荧光技术检测PDGF对RPE细胞迁移等影响;另外分别向细胞培养物中添加PD98059,SB203580和PI3K等不同的信号通路分子抑制剂,判断参与PDGF激活的细胞活动相关的信号通路.结果:外源性PDGF能促进体外培养的人RPE的增殖和迁移.ERK1/2选择性抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002能显著的降低PDGF-BB诱导的人RPE细胞的增殖(P＜0.05),p38抑制剂SB203580没有明显的抑制作用.而对PDGF-BB诱导的RPE细胞的迁移,SB203580和LY294002有显著的抑制作用(P＜0.05),PD98059抑制作用不显著.结论:PDGF对RPE细胞的影响提示其在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发展中有重要的作用,其可能为PVR提供一种新的毒副作用小的治疗手段.     

濒危物种胡杨和灰叶胡杨总DNA提取及RAPD体系优化

以濒危物种胡杨和灰叶胡杨硅胶干燥的叶片为材料,研究其总DNA提取方法及RAPD-PCR体系优化条件。结果表明,用改良CTAB法提取的DNA适用于胡杨和灰叶胡杨的RAPD分析。优化的胡杨和灰叶胡杨RAPD-PCR体系为:20μL的反应体系中含Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTP 0.15 mmol·L-1、引物0.2μmol·L-1、模板DNA100 ng和1.5 U Taq DNA聚合酶。用6条多态性引物对优化体系的稳定性进行检测,结果显示扩增结果稳定,多态性丰富。该优化体系为在分子水平开展胡杨和灰叶胡杨的保护生物学研究提供了技术支持和参考。     

新一代测序技术的研究进展

大规模DNA测序技术是揭秘人类和其它生物遗传密码的重要技术,在分子生物学和基础医学领域有广泛应用。第二代测序技术的出现使DNA测序的通量大幅提高,测序的成本大幅下降,原来只有在大型测序中心才能完成的测序任务现在已经可以在更多的实验室展开。但是,早期的第二代测序技术仍然存在诸如文库构建过程复杂、测序成本依然较高等缺点。为了克服上述缺点,近三年发展了几种新的第二代和第三代测序技术,这些技术不仅继承了早期第二代测序技术通量高的优点,而且在文库构建等方面取得了重要突破,进一步简化了测序操作,降低了测序成本,缩短了测序时间。本文就几种最新的大规模测序技术的原理、特点与发展趋势进行简要介绍。     

Dicentric chromosome formation and epigenetics of centromere formation in plants

Plant centromeres are generally composed of tandem arrays of simple repeats that form a complex chromosome locus where the kinetochore forms and microtubules attach during mitosis and meiosis. Each chromosome has one centromere region, which is essential for accurate division of the genetic material. Recently, chromosomes containing two centromere regions (called dicentric chromosomes) have been found in maize and wheat. Interestingly, some dicentric chromosomes are stable because only one centromere is active and the other one is inactivated. Because such arrays maintain their typical structure for both active and inactive centromeres, the specification of centromere activity has an epigenetic component independent of the DNA sequence. Under some circumstances, the inactive centromeres may recover centromere function, which is called centromere reactivation. Recent studies have highlighted the important changes, such as DNA methylation and histone modification, that occur during centromere inactivation and reactivation.     

生物工程药物生产纯化工艺研发指导思想和设计技巧

以重组DNA技术为特征的现代生物技术正在以产业发展形式实现其社会经济潜力。疾病和健康决定着人类的生存质量,医疗是我国人民最关心的问题之一,也是全球人民的重要需求。基因组学和蛋白质组学研究的进展使人类对疾病分子机制的认识更加深入,引起人们重新思考传统制药工业模式,