瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ及其CBD的噬菌体表面展示系统的构建

为研究纤维素酶的酶活性和吸附特性之间的关系,将瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ(endoglucanaseⅠ,EGⅠ)和其吸附结构域(cellulose-binding domains,CBD)的基因经PCR扩增后,连接到载体pCANTAB5E上,构建成噬菌粒展示载体pCANTAB5E-egⅠ和pCANTAB5E-egⅠ-cbd。将这些噬菌体展示载体转化到大肠杆菌TGⅠ中,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下得到重组噬菌体。用ELISA和Somogyi方法分别测定了EGⅠ及其CBD的表面展示噬菌体对纤维素的亲和性和EGⅠ的CMC活性,结果显示EGⅠ及其CBD已功能展示于噬菌体表面。该系统的成功构建为今后利用噬菌体展示的方法进行纤维素酶的酶分子改造提供了基础。     

黄瓜膨胀素的重组表达及活性分析

目的:提高纤维素的酶水解效率和开发高效的纤维素酶水解过程。方法:采用RT-PCR方法从黄瓜胚轴细胞中分离了膨胀素S1的cDNA,并使之与毕赤酵母表达质粒pPICZ(A连接,形成重组质粒pPICZ(A-exs1。通过电转化方法,用质粒pPICZ(A-exs1转化巴氏毕赤酵母GS115,得到重组菌株P.pastoris-exs1。在该重组菌株中,膨胀素的基因通过同源重组整合在毕赤酵母的染色体上,并处于毕赤酵母甲醇氧化酶启动子的下游。重组菌株P.pastoris-exs1在甲醇诱导下可合成并分泌膨胀素。结果:培养上清液没有纤维素酶活性,但具有破坏滤纸纤维素结晶结构的能力。培养上清液与里氏木霉纤维素酶等量混合后,可使纤维素酶的滤纸酶活力提高50%。结论:采用巴氏毕赤酵母GS115重组成功表达了黄瓜膨胀素,其表达产物可以促进纤维素酶对滤纸的水解。     

细菌纤维素生产菌株的分离和菌种初步鉴定

从长膜的醋醅中分离出一株发酵生产细菌纤维素产量较高且稳定的醋酸菌M12。根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版,对醋酸菌M12进行了形态和生理生化特征的分析、测定了G＋Cmol％含量,初步鉴定该菌为醋化醋杆菌木质亚种（Acetobacter xylinum subsp.xylinum,又称木醋杆菌）。     

真菌降解木质纤维素的功能基因组学研究进展

木质纤维素利用的核心问题之一是生物质的降解,即如何将生物质由高聚大分子降解为可发酵的小分子糖,又称为糖化。自然界中向胞外大量分泌降解生物质酶类的微生物主要是真菌,研究真菌木质纤维素降解途径的分子机理对生物质的综合利用意义重大,是木质纤维素能否实现全面生物炼制的关键之一。以下将针对真菌降解木质纤维素的研究进展,特别是对利用功能基因组学所取得的进展进行评述。     

作用于cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶的鉴定

【目的】本研究以革兰氏阳性细菌解纤维素梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)为研究对象,筛选作用于纤维小体编码基因簇cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶。【方法】通过对预测的4个假定编码核糖核酸内切酶基因进行基因敲除、体内过表达、体外过表达和活性分析等方法,分析它们对cip-cel mRNA剪切位点的剪切能力。【结果】敲除rnc和rnj基因,对cip-cel mRNA剪切没有任何影响;体内过表达RNase时能够加速cip-cel mRNA的降解,而过表达RNase G时,则结果与野生型对照菌株无异;RNase G基因rng和RNase Y基因rny的体外活性鉴定分析,发现RNase G对体外转录的包含cip-cel mRNA剪切位点的RNA没有作用,而RNase Y能够对其进行剪切和降解。【结论】RNase Y是能够作用于cip-cel mRNA的核酸内切酶。该研究结果对理解革兰氏阳性细菌核糖核酸内切酶的作用机制,及其在转录后水平的调控基因差异表达等方面具有重大意义。     

剔除灌草和添加翅荚决明对厚荚相思林土壤温室气体排放的影响

森林土壤是CO₂、CH₄和N₂O等温室气体的主要排放源.本研究采用静态箱/色谱分析技术,对中国科学院鹤山丘陵综合开放试验站内厚荚相思林土壤CO₂、CH₄和N₂O通量进行原位测定,研究剔除林下灌草和添加翅荚决明对土壤温室气体排放的影响.结果表明：厚荚相思林土壤CO₂通量在湿季维持较高水平,在旱季则明显降低.CH₄和N₂O在9-11月波动幅度较大,峰值出现在10月.在不同处理下,厚荚相思林土壤可能是CH₄的源也可能是CH₄的汇,而于CO₂和N₂O则是源.林下剔除灌草能显著增大土壤CO₂排放(P<0.05),而添加翅荚决明能加快土壤CH₄的排放(P<0.05).林下剔除灌草及添加翅荚决明两种处理都能够加大N₂O的排放通量.表层土壤温度、湿度、NO₃^--N和微生物生物量碳都是影响土壤温室气体排放的重要因子.     

不同木质纤维素基质上白腐菌降解特性的研究

通过测定木质素、纤维素、半纤维素和漆酶分泌的变化,研究白腐菌在稻草、木屑、粗纤维素、滤纸、黑液木素基质上的降解特性。结果表明,除黑液木素上白腐菌不能生长外,在前25d,各基质中纤维素、半纤维素和木质素含量呈持续下降趋势,之后,降解速率减少,其中木质素的降解速率大于纤维素和半纤维素的降解速率。漆酶分泌在生长初期呈快速上升趋势,第10d酶活达到最大,第10～20d快速下降,其后基本不变,基质中酶活大小顺序为稻草基质、木屑基质、粗纤维和滤纸基质,显示了木质素存在对漆酶分泌的诱导作用。     

植物纤维素生物合成及其相关酶类

纤维素是由成千上万个D-葡萄糖分子通过β-1,4糖苷键连接的具有一定立体构象的链状聚合物,其葡萄糖残基约为2000～25000个。它是细胞壁的主要组成成分之一。植物,大多数藻类,一些细菌和真菌甚至有些动物都能合成纤维素。它作为世界上最丰富的,具有巨大商业价值的生物多聚体,几十年来一直受到人们的重视,成为人们的研究热点。尽管如此,这方面的研究仍比较滞后,人们对纤维素生物合成途径及其相关酶类还是知之甚少。近几年来,随着基因组学的发展,关于纤维素的生物合成及相关基因表达调控的研究也成绩斐然,现就高等植物纤维素生物合成途径及其相关的纤维素合成酶的最新研究进展作一介绍。     

潜在木质纤维素能源植物香根草的初步研究

对南京试验地种植的香根草[ Vetiveria zizanioides (L.) Nash]叶片的光合特性和主要矿质元素含量以及株高生长速率进行了测定,并对来源于南京试验地和东台滩涂地的香根草叶片中与纤维特性有关的化学组分的含量及水解产物的含量进行了分析和比较.结果显示:香根草叶片的净光合速率(Pn)对光量子通量密度的响应曲线呈单峰型,Pn最高可达15.3 μmol·m-2·s-1,光饱和点为1 528.6 μmol·m-2·s-1;Pn日变化曲线呈明显的双峰型,峰值分别出现在10:00和15:00.叶片中K、N、Ca、P、Mg和S的含量分别为11.2、7.6、4.3、2.7、2.8和1.5mg·g-1.5月份至10月份是香根草的快速生长期,7月份的株高生长速率最高,达42.1 cm.种植于试验地和滩涂地的香根草叶片中纤维素、半纤维素和木质素的含量分别为326.1和321.7 mg·g-1、380.2和369.5 mg·g-1、147.8和154.0 mg·g-1,产地间差异不显著(P＞0.05);苯-乙醇抽提物和灰分的含量分别为59.5和54.1 mg.g-1、81.7和71.7 mg·g-1,产地间差异显著(P＜0.05).种植于试验地和滩涂地的香根草叶片水解产物中葡萄糖和木糖含量均较高,分别为368.3和359.9 mg·g-1、245.7和204.3 mg·g-1;阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖含量较低,三者的总含量仅为58.6和55.8 mg·g-1;其中,仅木糖含量产地间具有显著差异(P＜0.05).研究结果表明:香根草具有很强的光合能力及较快的生长速率,叶片中纤维素和半纤维素含量均较高,能够适应边际性土地种植,是一种潜在的优良木质纤维素能源植物.     

纤维二糖水解酶Ⅰ吸附结构域的新功能

从拟康氏木霉S-38中分离纯化得到的外切酶Ⅰ(CBHI),经过木爪蛋白质酶的有限酶解后通过一系列的柱层析分离获得其吸附结构域(CBM).利用CBM与纤维素在40℃下作用24h后,利用红外光谱测定纤维素结构的变化,发现纤维素的氢键作用减弱,利用分子动力学模拟进一步确认实验的结果,并从纳米尺度上阐明了在CBM分子吸附作用于纤维素表面的过程中纤维素链间的氢键作用明显降低.本研究表明CBM分子不仅具有使CBHI分子定位于纤维素表面的作用,还会在吸附过程中导致纤维表面结构的破坏.本研究为CBHI分子催化结构域与吸附结构域分子间的协同模型提供了一重要证据.