缺刻缘绿藻磷脂酶A2(PLA2)的基因特征与功能

为进一步鉴定磷脂酶A2(PLA2)在缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)油脂合成过程中的具体功能,研究利用RACE技术从缺刻缘绿藻H4301中克隆到pla2基因(Mipla2)的cDNA序列全长,共1082 bp。该全长包含180 bp的5′-非翻译区(UTR), 464 bp的3′-UTR和438 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由145个氨基酸组成的蛋白。其基因全长为1594 bp,含有3个内含子和4个外显子。多序列比对结果显示, MiPLA2具有保守的Ca²⁺结合基序和催化活性基序。系统演化分析结果显示MiPLA2属于植物s PLA2-XIA家族。利用同源重组技术构建了pET32aMipla2原核表达载体,经过诱导和纯化,得到了分子量大小为31.36 kD的重组MiPLA2蛋白。体外酶促反应的产物经薄层层析分析显示,重组表达的MiPLA2具有催化磷脂酰胆碱(PC)水解成溶血磷脂酰胆碱(LPC)的功能。研究结果有助于解析花生四烯酸被优先用于三酰甘油(TAG)合成的途径与机理,为通过pla2基因的遗传改造提高该藻油脂产率的应用研究奠定了基础。     

NaCl胁迫下宁夏枸杞光合作用相关基因差异表达分析

宁夏枸杞是著名的耐盐药用植物,该研究通过室内水培试验,利用高通量测序技术和qRT-PCR技术检测了不同浓度NaCl胁迫(0、100、200、300 mmol/L)下宁夏枸杞叶片光合作用相关基因差异表达,并分析了其叶绿素含量、净光合速率、Rubisco活性的变化,以揭示宁夏枸杞在盐胁迫条件下光合机构及光合作用相关基因差异表达规律,为深入解析宁夏枸杞响应盐胁迫的光合机理奠定基础。结果表明：(1)用100、200、300 mmol/L NaCl胁迫处理7 d时宁夏枸杞分别有14、26、55个光合作用相关基因差异表达,且随着NaCl胁迫程度的增加下调表达基因多于上调表达基因。(2)qRT-PCR结果显示,宁夏枸杞的3个光合作用相关基因ATPε、CLH2、Lhcb3的相对表达量均随着NaCl胁迫程度的加深总体呈显著下降的趋势,qRT-PCR验证结果与RNA-seq测序结果基本一致。(3)随着NaCl胁迫程度的增加,宁夏枸杞叶片中的叶绿素a和叶绿素b含量以及净光合速率和Rubisco活性均呈显著下降的趋势,而类胡萝卜素含量变化不显著。研究认为,宁夏枸杞能通过诱导光合作用相关基因的差异表达来调控叶片...     

滇水金凤转录因子TT8的克隆及表达分析

为探究滇水金凤(Impatiens uliginosa L.)TT8(TRANSPARENT TESTA 8)基因的功能和表达特性,并解析其对滇水金凤花色的影响,研究以滇水金凤花器官为材料,通过RT-PCR等技术克隆IuTT8基因,并对其进行生物信息学分析;利用qRT-PCR分析该基因在不同花色和不同花发育阶段的表达模式。结果表明,(1)成功克隆得到滇水金凤IuTT8基因,其编码区全长为2 136 bp,编码711 aa,为亲水性不稳定蛋白,gDNA全长为3 938 bp,共有6个内含子;结构域分析发现该蛋白属于bHLH超家族成员,与喜马拉雅凤仙花、山茶等物种的TT8蛋白同源且Motif基序相似。(2)IuTT8与同属植物喜马拉雅凤仙花的聚在一支,相似性约86.34%;多序列比对和系统进化分析显示TT8蛋白的结构域高度保守。(3)IuTT8基因在4种不同花色滇水金凤及其4个不同发育阶段均有表达,除白色外,其表达量均随花发育的进行呈先升后降的趋势;且IuTT8基因的表达量与花色呈正相关,其中以深红色表达量最高,白色表达量最低,深红色S3的表达量约为白色S2时期的48倍。研究表明滇水金凤I...     

细菌与免疫疗法联用的抗肿瘤策略

利用细菌作为一种癌症治疗手段已有较长的历史。随着对肿瘤微环境和免疫机制等相关问题的不断探究,细菌疗法已逐渐发展成为一种平台技术,为肿瘤的免疫治疗开辟了新策略、新潜能。某些细菌依靠其自身特性,能够特异性靶向肿瘤组织,不仅对肿瘤生长产生直接抑制作用,还能刺激机体产生固有和适应性免疫应答,从而显著提升抗肿瘤治疗的疗效,甚至有助于解决转移性肿瘤等难题。通过基因工程技术,从基因水平上调控细菌的分子机制来定制其生物功能,高效递送各种免疫治疗剂至肿瘤病灶处而发挥作用,达到精确调控、有效激活的目的,这是其他药物传递系统所无法比拟的。此外,肿瘤靶向型细菌介导的治疗方案既可作为单一疗法应用,也可与其他治疗方式如化疗、放疗和光热治疗等联合,以获得更佳的临床治疗结果。因此,该文主要讨论了活细菌发挥肿瘤靶向性和抗肿瘤免疫作用的关键,总结了生物工程菌用于免疫治疗的相关研究及其与其他治疗方式联合应用的优势,为细菌疗法的进一步研究与发展提供依据。     

火龙果溃疡病菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

火龙果溃疡病是由火龙果溃疡病菌引起的重要真菌病害,近年来在世界火龙果产区的爆发严重影响了火龙果产业的发展。为研究火龙果溃疡病菌响应逆境胁迫的基因表达和功能,需要筛选火龙果溃疡病菌在各种条件下表达稳定的内参基因。以火龙果溃疡病菌菌株LJ02为研究对象,以在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDW）培养的菌丝体为对照组,以在LB培养基培养的菌丝体和分别在添加过氧化氢、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑的PDW培养的菌丝体为处理组。利用实时荧光定量PCR技术以及内参基因稳定性评估软件（geNorm、NormFinder、Bestkeeper和RefFinder）,评估18个候选内参基因（CYT1、SDH2＿1、TBCC、SUI1、RPL19、PPH、ATP5B、UBE2＿16、RPL13、UBE2＿2、PRS17、SUCLA2、ATP5A、TUB1＿2、ACT1、EFTU、EF1A和GAPDH）的表达稳定性。结果显示,火龙果溃疡病菌的18个候选基因在上述培养条件下的Ct值介于14.80-24.66之间,表达水平适中;稳定性最高的内参基因是CYT1,其次为SUI1,GAPDH和ACT1的稳定性最差;最少使用2个内参...     

真核表达纯化的SARS-CoV-2 N蛋白在不同人群血清检测中的应用性能分析

通过真核系统表达纯化新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的全长核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,N蛋白）,分析其抗原性与应用性能。将SARS-CoV-2 N蛋白表达质粒转染HEK-293T细胞后,通过Western Blot和免疫荧光验证蛋白表达以及表达定位。对N蛋白进行纯化后,通过Western Blot和ELISA并采用多种血清样本（WHO参比品血清、正常人血清、新冠灭活疫苗接种后血清、新冠感染者恢复期血清）对该N蛋白在血清抗体检测中的应用性能进行分析。比较真核系统与原核系统表达的N蛋白抗原性上的差异,并分析基于真核系统表达N蛋白构建的IgG抗体ELISA检测体系与获批的商品化新冠RBD (Receptor binding domain)IgG抗体ELISA检测试剂盒及用于检测中和抗体的活病毒微量中和试验结果间的相关性。结果显示,真核系统表达的全长N蛋白主要定位于胞质,作为抗原检测新冠IgG抗体,具有比原核系统表达的N蛋白更高的检测灵敏度。针对新冠感染者恢复期血清,基于哺乳动物细胞表达的N蛋白构建的ELISA体系检测的IgG抗体滴度与试剂盒检测的RBD-IgG抗...     

利用CRISPR/Cas9系统构建ITGαV及ITGβ3敲除细胞系

本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(Integrin αV,ITGαV)及整合素β3(Integrin β3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR‐V2载体上,与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293 T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαV^KO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST‐ITGβ3^KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试...     

猪轮状病毒感染小鼠肠道组织的转录组分析

猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）是在世界范围内与严重腹泻疾病相关的主要肠道病原体,是新生仔猪肠炎和腹泻致死的重要原因之一。为了深入了解猪轮状病毒感染肠道后其致病机制以及引起宿主的抗病毒和修复机制,我们分别饲喂培养基和猪轮状病毒病毒液5d后,采取5 d、10 d、15 d、20 d、25 d小鼠空肠组织进行高通量转录组测序分析。利用基因本体论（Gene Ontology,GO）数据库功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析差异表达基因（Differentially Expressed Gene,DEGs）,选取部分差异表达基因,进行qRT-PCR验证。结果显示,与对照组相比,5个时间段上调DEGs有849个,下调DEGs有824个。对DEGs进行5个功能富集,有共同差异基因15个。这些差异表达基因广泛参与脂质合成与代谢、免疫、细胞增殖、细胞凋亡等活动,主要注释到PPAR、NOD-like、IL-17等信号通路中。qRT-PCR验证上皮细胞增殖相关基因PBLD、C...     

拟南芥ACOL8基因在乙烯合成与响应中的功能分析

植物激素乙烯在多种生理生化过程中发挥重要作用,但其在特定组织器官中的合成机制尚不完全清楚。拟南芥中存在12个功能未知的ACC氧化酶类似蛋白（ACO-like homolog,ACOL）,运用基因定点编辑技术构建了ACOL8的功能丧失型突变体,发现该基因的突变削弱了经典的乙烯“三重反应”。与野生型相比,突变体黄化幼苗下胚轴及主根的长度显著增加,这与突变体对外源ACC的敏感性下降现象一致。同时还发现ACOL8基因的表达受乙烯信号的正反馈调控,EIN3过表达增强其表达水平,而etr1-3的突变则产生相反效应。再者,在正常条件下,ACOL8基因的突变并未影响拟南芥的生长;但在盐胁迫条件下,突变体的根冠比显著下降,这说明该基因参与植物的盐胁迫响应。综上,这些结果说明ACOL8可能具有ACC氧化酶的功能,参与乙烯的合成与响应。