Photorespiration in the context of Rubisco biochemistry,CO2 diffusion and metabolism

Photorespiratory metabolism is essential for plants to maintain functional photosynthesis in an oxygen‐containing environment. Because the oxygenation reaction of Rubisco is followed by the loss of previously fixed carbon, photorespiration is often considered a wasteful process and considerable efforts are aimed at minimizing the negative impact of photorespiration on the plant’s carbon uptake. However, the photorespiratory pathway has also many positive aspects, as it is well integrated within other metabolic processes, such as nitrogen assimilation and C₁ metabolism, and it is important for maintaining the redox balance of the plant. The overall effect of photorespiratory carbon loss on the net CO₂ fixation of the plant is also strongly influenced by the physiology of the leaf related to CO₂ diffusion. This review outlines the distinction between Rubisco oxygenation and photorespiratory CO₂ release as a basis to evaluate the costs and benefits of photorespiration.     

Genetic variants and underlying mechanisms influencing variance heterogeneity in maize

Traditional genetic studies focus on identifying genetic variants associated with the mean difference in a quantitative trait. Because genetic variants also influence phenotypic variation via heterogeneity, we conducted a variance‐heterogeneity genome‐wide association study to examine the contribution of variance heterogeneity to oil‐related quantitative traits. We identified 79 unique variance‐controlling single nucleotide polymorphisms (vSNPs) from the sequences of 77 candidate variance‐heterogeneity genes for 21 oil‐related traits using the Levene test (P < 1.0 × 10^?5). About 30% of the candidate genes encode enzymes that work in lipid metabolic pathways, most of which define clear expression variance quantitative trait loci. Of the vSNPs specifically associated with the genetic variance heterogeneity of oil concentration, 89% can be explained by additional linked mean‐effects genetic variants. Furthermore, we demonstrated that gene × gene interactions play important roles in the formation of variance heterogeneity for fatty acid compositional traits. The interaction pattern was validated for one gene pair (GRMZM2G035341 and GRMZM2G152328) using yeast two‐hybrid and bimolecular fluorescent complementation analyses. Our findings have implications for uncovering the genetic basis of hidden additive genetic effects and epistatic interaction effects, and we indicate opportunities to stabilize efficient breeding and selection of high‐oil maize (Zea mays L.).     

部分扩增与双片段连接相结合制作长基因定点突变

重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题。此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒。若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒。以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒。两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性。该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案。     

马蔺IlWRKY28基因的克隆与表达分析

马蔺(Iris lactea var. chinensis)是鸢尾属多年生草本盐生植物,具有很高的耐盐性和观赏价值。为研究马蔺耐盐的分子机制,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)从马蔺中克隆到一个WRKY转录因子基因IlWRKY28,获得了1 302 bp的全长cDNA序列,其包含一个108 bp 5′末端非翻译区(UTR),一个174 bp 3′末端UTR和一个1 020 bp开放阅读框。IlWRKY28编码339个氨基酸,预测的蛋白质分子量为37.22 kD,等电点为7.04。氨基酸序列分析显示,IlWRKY28包含一个保守的WRKY基序和一个C2H2型锌指结构域。系统发育分析表明,马蔺IlWRKY28与菠萝(Ananas comosus)AcWRKY28和藏北嵩草(Kobresia littledalei)ClWRKY28亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,盐处理后,IlWRKY28基因在马蔺地上部显著上调表达。该研究结果为进一步研究IlWRKY28在马蔺适应高盐胁迫中的功能和作用机制奠定了重要的分子基础。     

金鱼草AmPDS基因克隆及调节类胡萝卜素合成功能分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素进行生物合成途径中的关键酶。为了深入探究金鱼草PDS基因的功能,该研究以‘马里兰’金鱼草(Antirrhinum majus‘Maryland True Pink’)为材料,对其PDS基因(AmPDS)全长序列及蛋白结构进行分析,并克隆了AmPDS基因片段;采用qRT-PCR技术检测AmPDS基因在不同时期及部位的相对表达水平,利用VIGS技术验证AmPDS基因功能,用紫外分光法测定叶片中各类色素含量。结果显示:(1)成功克隆AmPDS基因片段(500 bp);AmPDS基因cDNA全长1743 bp,编码580个氨基酸;其蛋白分子量为64.75 kD,理论等电点6.66;同源比对分析显示AmPDS基因与芝麻(Sesamum indicum)的序列相似性最高。(2)qRT-PCR分析表明,AmPDS基因在全株均有表达,且在全盛期花朵的上瓣和叶片中表达量最高。(3)构建pTRV2-AmPDS载体,建立了金鱼草的VIGS沉默体系,AmPDS基因沉默效率约为53%,与阴性对照相比叶片中各类色素含量均显著降低。研究认为,AmPDS基因是金鱼草类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因,可作为金鱼草VIGS沉默体系的指示基因,为后续研究金鱼草其他基因功能奠定基础。     

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。     

产瓦伦西亚烯酿酒酵母的表达载体适配及发酵碳氮源优化

瓦伦西亚烯是一种倍半萜类化合物,广泛应用于香水、香皂、食品和饮料等工业制造上。但由于其自然含量极低,且目前获取瓦伦西亚烯的方法较为麻烦且花费高,因而构建细胞工厂进行瓦伦西亚烯的生物合成是更为高效和环保的方法。选取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主构建细胞工厂,先在酿酒酵母基因组上引入黄扁柏的瓦伦西亚烯合成酶(Valencene synthase from Callitropsis nootkatensis,CnVS),实现瓦伦西亚烯的初步合成,初始产量为4.16 mg/L。随后利用CRISPR/Cas9系统对酿酒酵母中Mevalonate(MVA)途径的erg9和rox1基因进行敲除,提高通往瓦伦西亚烯合成的碳流量。不同碳氮源浓度发酵的结果表明,细胞生长积累过高可能不利于瓦伦西亚烯的积累。最后探究了不同CnVS表达载体对瓦伦西亚烯产量的影响,并获得17.54 mg/L的最高产量,是出发菌株的4.2倍。     

转基因植物与近缘种之间基因流的研究进展

随着转基因植物的大面积种植,转基因植物的生态风险受到广泛关注,其中主要的风险是转基因植物与近缘物种之间的基因流及其影响。本文综述了目前商业化种植的转基因作物油菜、棉花、玉米和大豆,以及未商业化种植的水稻、小麦的基因流研究进展;分析了不同转基因作物与其近缘种之间发生基因流的频率和最远发生距离;介绍了降低基因流发生的方法。基因流频率受物种亲缘关系、花期重叠时间、风速风向等因素的影响,最远发生距离受气候条件、传粉媒介、地理条件等因素的影响。转基因作物与其近缘种之间的基因流频率与距花粉源的距离呈负相关关系(y=-0.59x-0.46,R²=0.25,P<0.01),亲缘关系近的基因流频率高。为了降低转基因植物与其近缘物种之间的基因流风险,建议采取“分区管理”的策略,并加强基因流发生之后的生态风险评价研究。