蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10于大肠杆菌不同载体的可溶性表达策略研究

蒙古黄芪病程相关蛋白（Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10, AmPR-10）具有核酸酶活性,对黄芪生长发育及抗病机制具有重要意义。但从天然黄芪中提取蛋白质的传统方法成本较高,蛋白得率较少。研究首次利用大肠杆菌表达体系对AmPR-10进行可溶性外源表达,构建了3种重组子：①以pET28a为载体构建pET28a-AmPR-10;②以pET30a为载体构建pET30a-AmPR-10;③以pET30a为载体、大肠杆菌分子伴侣skp修饰构建pET30a-skp-AmPR-10。通过SDS-PAGE分析,目的蛋白可溶性表达量比较结果是：pET30a-skp-AmPR-10 > pET30a-AmPR-10 > pET28a-AmPR-10。由蛋白质三级结构模拟分析发现,载体pET-30a上的标签S-tag通过影响AmPR-10局部α螺旋构象而提高目标蛋白的可溶性表达,分子伴侣skp通过提高融合蛋白整体α螺旋比例进一步提升目标蛋白可溶性表达量。研究解决了目前从天然黄芪中提取蛋白操作复杂、提取量小的问题。同时,经测定,目的蛋白具有核酸酶活性,为外源AmPR-10相关活性研究提供了依据。     

九香虫保幼激素环氧水解酶基因克隆、生物信息学及表达分析

[目的]保幼激素环氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)是昆虫体内保幼激素(Juvenile hormone,JH)的主要降解酶.本文旨在分析九香虫Aspongopus chinensis Dallas保幼激素环氧水解酶基因序列(AcJHEH)信息,探索其在九香虫生长发育过程中的作用.[方法]以九香虫成虫的cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得AcJHEH基因序列,并利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析;采用qRT-PCR技术检测并分析九香虫不同龄期和不同组织中AcJHEH的相对表达量.[结果]成功获得了AcJHEH的完整开放阅读框ORF序列,全长均为1 363 bp,共编码453个氨基酸,预测分子量为51.74 ku,等电点(pI)为7.66,分子蛋白式C2414H3683N581O653S14,含有N-端跨膜基序XWG、催化三联体、保守基序HGWP和2个酪氨酸,属于环氧水解酶家族.系统进化树分析表明,AcJHEH与茶翅蝽Halyomorpha halys的JHEH聚为一支,再与同为半翅目的臭虫Cimex lectulariu和绿盲蝽Apolygus lucorum的JHEH聚为一类.荧光定量PCR结果显示,AcJHEH在九香虫不同发育阶段和各组织中均有表达,且脂肪中的表达量极显著高于其它组织(P＜0.001);滞育九香虫成虫表达量最高,其次为4-5龄若虫都极显著高于其它发育阶段(P＜0.001).[结论]九香虫JHEH属于环氧水解酶家族,确定为保幼激素环氧水解酶.依据qPCR结果推测AcJHEH通过改变九香虫体内保幼激素浓度来影响九香虫4-5龄若虫蜕皮发育、成虫生殖系统发育和滞育等.     

茶树DELLA基因家族的鉴定及表达分析

利用生物信息学方法,从茶树（Camellia sinensis（L.）O.Ktze.）全基因组数据库中分析获得DELLA蛋白的家族成员,并对它们的系统进化关系、蛋白序列特征、基因表达特异性及其与茶树次生代谢物的相关性进行分析。结果显示：茶树基因组中共有5个DELLA基因,分别为：TEA009882（CsGAI）、TEA022818（CsRGA1）、TEA010112（CsRGL1）、TEA008736（CsRGL2）和TEA020933（CsRGL3）;其编码的氨基酸数量在525~594之间,均定位于细胞核。该蛋白的二级和三级结构分析结果表明,茶树DELLA蛋白结构中含有大量的α螺旋及少量β转角结构。蛋白保守结构域分析结果显示该蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）具有高度的同源性,均具有GRAS、DELLA等保守结构域。基因的表达特异性分析结果表明,在茶树不同组织部位中,TEA009882、TEA022818和TEA010112基因的表达量均较高,而TEA020933和TEA008736的表达量在各组织中均较低;茶树DELLA基因的表达受到干旱、NaCl、低温及茉莉酸甲酯等非生物逆境胁迫的调控,且其表达量与茶树次生代谢物的积累间存在相关性。推测茶树DELLA基因广泛参与了茶树生长发育及非生物逆境胁迫的响应,以及对次生代谢物生物合成过程的调控。     

中华蜜蜂AcNPC2b的原核表达和鉴定

[目的]中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂),其胞内胆固醇转运体AcNPC2a能够识别并结合几种微生物的细胞壁,AcNPC2存在于该蜂触角,参与嗅觉通讯,关于AcNPC2b的功能尚未见报道.[方法]通过对中华蜜蜂AcNPC2b基因进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清;利用荧光定量PCR和免疫印迹检测AcNPC2b的转录活性及蛋白水平,通过微生物结合测定对AcNPC2b的功能进行探索.[结果]中蜂AcNPC2b含有信号肽和ML结构域,具有3个二硫键,与果蝇Drosophila melanogaster DmNPC2b聚为一个亚枝.荧光定量qRT-PCR检测发现,感染中蜂囊状幼虫病毒(Chinses sacbrood virus,简称CSBV)的幼虫体内AcNPC2b基因的表达呈现出先微弱下调再持续上调的趋势.获得了约16ku的重组蛋白AcNPC2b并制备了多克隆抗体,免疫印迹结果表明,中蜂AcNPC2b蛋白在工蜂头、胸与中肠中的表达量最高,触角、马氏管与脂肪体中次之.AcNPC2b蛋白在正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫中均有表达,且在感染CSBV的中蜂幼虫中有微弱上调.重组蛋白AcNPC2b微生物结合测定实验结果显示中蜂AcNPC2b重组蛋白均能与活的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌以及白僵菌结合.[结论]正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫体内AcNPC2b基因转录水平和AcNPC2b蛋白的表达含量存在差异,重组蛋白AcNPC2b具有识别并结合病原菌的能力,为后续深入研究AcNPC2b蛋白的分子功能奠定了一定理论基础.     

西伯利亚蝗抗菌肽基因的克隆及表达特性研究

[目的]扩增西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus抗菌肽(attacin)基因,并对其进行生物信息学分析,同时分析西伯利亚蝗不同组织中抗菌肽基因的差异表达.[方法]基于RACE技术从西伯利亚蝗中克隆得到抗菌肽,利用生物信息学软件对西伯利亚蝗抗菌肽的一级结构、二级结构、三级结构、系统进化和亚细胞定位进行分析.采用实时荧光定量PCR技术检测了西伯利亚蝗抗菌肽基因在马氏管、中肠、后肠、脂肪体和唾液腺中的相对表达量.[结果]克隆获得的抗菌肽基因的开放阅读框为282 bp,编码93个氨基酸,其编码蛋白预测理论分子量为9.98 ku,等电点为9.26.抗菌肽氨基酸序列中存在信号肽序列.基因定量分析显示,抗菌肽基因在西伯利亚蝗的中肠中表达量最高.[结论]attacin在西伯利亚蝗成虫不同组织中差异表达,提示其消化道在防御病原微生物的入侵中起着重要的作用.     

中华蜜蜂气味受体基因AcerOR58的序列与时空表达分析

[目的]通过分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味受体基因AcerOR58编码蛋白的理化性质、结构特征,明确AcerOR58时空表达特性,为该基因后续的功能研究奠定基础.[方法]利用多种生物信息学软件预测分析AcerOR58序列及其编码蛋白的结构特性,采用邻接法构建系统进化树.利用实时荧光定量PCR技术分析AcerOR58在不同发育阶段工蜂触角及采集蜂不同组织的表达差异.[结果]AcerOR58基因的开放阅读框(ORF)长1 230 bp,编码409个氨基酸,成熟蛋白分子量为47.147 ku,理论等电点8.46,无信号肽,含有6个跨膜结构且N端位于胞内,31个潜在的磷酸化位点,在第80-405位氨基酸之间存在一个昆虫气味受体家族7tm_6 superfamily保守结构域.AcerOR58与西方蜜蜂Apis mellifera的AmelOR58亲缘关系最近,核苷酸序列一致性高达96.67％,氨基酸序列一致性高达97.31％.AcerOR58在采集蜂(15-25日龄)阶段的表达量较高,且在触角中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01).[结论]AcerOR58具有昆虫气味受体的结构特征,该基因特异性高表达于中华蜜蜂采集蜂触角中,推测其功能与识别外界蜜粉源的花香气味物质有关.     

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

甲基营养菌MP688萄糖脱氢酶基因分离鉴定及性质研究

目的：鉴定甲基营养菌MP688中的葡萄糖脱氢酶基因。方法：对甲基营养菌MP688基因组序列进行比对和分析,找到与已知细菌葡萄糖脱氢酶同源性最高的基因序列mpq_2164,且该基因所编码蛋白经分析具有跨膜结构域。设计51物扩增mpq_2164和缺失跨膜区域序列的s-mpq_2164,将PCR产物克隆到表达载雄pET-15b上,在大肠杆菌BL21中完成异源重组表达,然后通过组氨酸标签镍柱亲和层析纯化,采用DCIP法测定葡萄糖脱氢酶的活力。结果：分离了甲基营养菌MP688中的葡糖糖脱氢酶基因,并实现了s-mpq_2164的高效异源重组表达;MPQ2164的氯基酸序列与已知的葡萄糖脱氢酶相似性很低,但酶活测定结果表明S-MPQ-2164具有很高的葡糖糖脱氢酶活性。结论：MPQ_2164是-个依赖于吡咯喹啉醌的葡萄糖脱氢酶,去掉跨膜结构域有利于该蛋白的异源嘉{大,     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。