Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

利用PCR和TA克隆方法扩增和克隆得到了恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S1的海藻糖合成酶基因treS.对其进行序列分析表明,其编码区含有2067bp,编码含688个氨基酸残基的蛋白质,其核苷酸序列和蛋白质序列与来源于其它假单胞菌属细菌的海藻糖合成酶的序列表现出了较高同源性.将该基因序列与表达载体pQE30T连接,构建重组质粒pQE30T-TS,并将其转化至E.coli M15菌株中.重组菌株经诱导表达后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有明显的分子量约77.5kD的特异蛋白条带出现.经测定酶活力达19U/mL,约是原始菌株P.putida S1的50倍.     

细菌萜类合成酶的生物信息学分析

【目的】目前对于萜类合成酶(Terpenoid synthase,TPS)的研究主要集中在植物和真菌中,而对细菌TPS的系统研究尚少。建立在大量已经被测序的细菌基因组基础上,利用生物信息学方法,对细菌TPS在全基因组范围内进行识别、分类和功能分析。【方法】利用TPS的隐马尔科夫模型(Pfam编号为PF03936)搜索自建的细菌蛋白质组数据库,预测出细菌TPS。对这些候选TPS的蛋白序列用MAFFT 7.130b进行多序列比对,并利用MEGA 6.0对多序列比对结果进行进化分析。利用MEME和PredictProtein分别进行细菌TPS的基序(Motifs)和点突变分析。【结果】建立在生物信息学分析的基础上,1 423条细菌TPS被识别,它们分布在8个门中,即放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和衣原体门(Chlamydiae)。进化分析表明细菌TPS可分为4大类,Motifs分析表明除了各类之间保守的基序(Motifs)外,还有特异的Motifs,这暗示着细菌TPS在不同类别之间的功能分化。点突变分析表明,细菌TPS不同位点的氨基酸突变对TPS功能的影响不同。【结论】细菌TPS主要分布于8个门中,其中在2个门中细菌TPS尚未见报道,即厚壁菌门(Firmicutes)与酸杆菌门(Acidobacteria)。基于进化分析,可以把细菌TPS分为4类,各类之间的差异可能是由类特异的Motifs决定的,另外细菌TPS不同氨基酸位点的突变分析为今后验证TPS的功能提供了很好的理论基础。     

高盐下条斑紫菜光合特性和S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因表达的变化

为了研究条斑紫菜耐盐机理,对条斑紫菜叶状体进行了高盐胁迫处理,继而采用氧电极法测量了光合放氧速率和呼吸耗氧速率的变化,采用实时荧光定量PCR技术测量了S-腺苷甲硫氨酸合成酶(命名为PySAMS)基因的表达变化。结果显示藻体的光合与呼吸作用均受到高盐度海水的显著影响,随着盐度的增加,光合放氧率逐渐降低,呼吸耗氧率也逐渐降低。高盐度海水对PySAMS基因表达量也产生了显著影响,40和50盐度的海水诱导了PySAMS表达,但60至80盐度的海水却不同程度地抑制了PySAMS表达。据此推测,在面对较高盐度胁迫时条斑紫菜叶状体将逐步降低体内新陈代谢以度过不良环境。     

猪链球菌2型唾液酸合成酶neu B基因敲除突变株的构建及其生物学特性

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33唾液酸合成酶neuB基因敲除突变株。PCR和Southern杂交结果均显示neuB基因在1株转化重组体中完全被壮观霉素抗性基因替代, 表明neuB基因敲除突变体构建成功。生物学特性鉴定显示, 突变体与强毒株在菌落形态、溶血活性以及染色特性方面均无明显差异; 电镜检查发现突变体表面结构组分与强毒株有显著差异, 荚膜明显变薄, 质地更加紧密; 小鼠致病性试验结果显示, 突变体毒力显著减弱。研究结果提示菌体荚膜中的唾液酸对于猪链球菌2型侵袭和致病具有重要作用。     

肥胖及2型糖尿病大鼠Alzheimer病样Tau蛋白过度磷酸化修饰及机制探讨

Tau蛋白异常过度磷酸化修饰在阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)发病机理中起非常重要的作用,而2型糖尿病是AD的风险因素之一.采用蛋白质印迹研究2型糖尿病及单纯肥胖大鼠脑中海马回tau蛋白磷酸化程度,发现在这两种大鼠模型中海马tau蛋白在多个位点上都呈现过度磷酸化状态.同时,胰岛素信号传导系统中的关键酶糖原合成激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)活性在这两种大鼠模型的海马回中明显增高,经脑立体定位法向大鼠海马回注射GSK-3β抑制剂氯化锂(LiCl),可阻止2型糖尿病及肥胖大鼠模型中的GSK-3β激活,但仅阻止单纯肥胖大鼠海马回tau蛋白过度磷酸化.另外,海马神经细胞膜上胰岛素受体β亚基水平在两种实验模型中显著下降.研究结果表明,2型糖尿病及肥胖可能通过增高胰岛素抵抗,从而导致GSK-3β激活和tau蛋白的过度磷酸化来提高AD的发病风险.2型糖尿病脑中低下的葡萄糖代谢也可能在tau蛋白的过度磷酸化起一定作用.     

北京红篓菌聚羟基烷酸合成酶基因的克隆与表达

以北京红篓菌基因组DNA为供体,pKC505 cosmid质粒为载体系统,λ噬菌体体外包装重组质粒并转染感受态细胞E.coli JM109,构建了该菌株基因组DNA文库。以聚羟基烷酸（PHA）合成酶基因通用简并引物扩增的PHA合成酶部分基因为探针,经DIG标记后利用菌落原位杂交技术对文库进行筛选,获得3个阳性克隆菌株,PCR检测证明这3个克隆具有PHA合成酶基因片段,酶活测定表明3个克隆都具有PHA合成酶及与PHA合成相关的乙酰乙酰辅酶A还原酶的活性。     

紫杉醇合成代谢途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

紫杉烯合成酶(Taxadienesynthase)被认为在紫杉醇合成代谢途径中起着限速酶的作用。为进一步研究紫杉烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RTPCR技术从东北红豆杉(Taxuscuspidata)愈伤组织中获得了紫杉烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMTEasyVector上,并转化到大肠杆菌JM109中,经EcoRI酶切检测,Southernblotting及部分cDNA序列分析证实该片段确为紫杉烯合成酶基因,与国外报道的从太平洋红豆杉(Taxus.brevifolia)幼茎中得到的紫杉烯合成酶基因序列具有很高的同源性。     

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP 酶活性的调节

肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase, MLCK）具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6-5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western 印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段（F6.5和F6-5/D）,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg²⁺-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段（F6.5）使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.     

[反]-β-法尼烯合成酶基因在植物抗蚜分子育种中的应用

蚜虫是重要的农业害虫,每年造成数以亿计的经济损失。[反]-β-法尼烯[(E)-β-farnesene,EβF]是绝大多数蚜虫报警信息素的主要成分,可使蚜虫产生骚动、从植株上脱落,并吸引蚜虫天敌,有效控制蚜虫危害。EβF合成酶是催化合成EβF的关键酶,目前该基因已从薄荷、香橙、花旗松、黄花蒿、洋甘菊等植物中得到分离鉴定。植物中表达EβF合成酶基因以催化法呢基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP)合成EβF是控制蚜虫危害的重要策略。文中概括了当前植物抗蚜转基因研究现状,综述了植物EβF合成酶基因及其在植物抗蚜分子育种中的应用。针对当前转基因植物的EβF生成量较低等问题,展望了EβF合成酶基因在植物抗蚜分子育种中的应用前景和研究策略。     

葡萄糖有氧氧化和ATP的生成量

能量是一切生物体活动所必需的。生物体所需的能量一般来自于体内有机物的氧化。糖、脂肪、蛋白质等有机物在细胞内氧化分解 ,释放出二氧化碳、水和能量的过程称生物氧化。生物氧化包括许多复杂的生物化学反应 ,不同的有机物虽有各自的分解氧化过程 ,但最终都经历共同的终末代谢途径。总体包括四个阶段 (图 1 )。生物氧化中的能量代谢具有两个明显的特点 :一是生物氧化中能量是逐步缓慢释放的 ,这样放出的能量易得到最有效的利用 ;其次 ,生物氧化过程产生的能量通常先贮存在能量通货ＡＴＰ中 ,通过ＡＴＰ再满足机体的能量需要 ,并且ＡＴＰ主…