用重组大肠杆菌JM109(pKST11)转化苯生产顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯

顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯（简称DHCD）是航天业、电子工业、医药业以及精细化工业上重要的手性化合物。利用重组E. coli JM109 (pKST11),采用适时监测发酵过程中全细胞甲苯双加氧酶（Toluene dioxygenase,TDO）活性的方法,研究了发酵生产DHCD工艺中的重要影响因子IPTG以及底物苯的供给方式对DHCD产量的影响。研究结果表明：（1）发酵初期利用IPTG诱导TDO的表达,不利于细胞生长,在对数生长中期（6或8h）,采用0.5mmol/L IPTG即可诱导出TDO的最高表达。（2）发酵液中的苯对全细胞甲苯双加氧酶(TDO)的活性有抑制作用,而利用液体石蜡作为缓释剂进行两相法发酵则降低了苯的毒害,明显提高了DHCD的产量。当采用传统的通气供苯方法,DHCD的产量仅有75 g/L;批式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量提高到226 g/L,是通气供苯法的3倍;而采用流加的方式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量进一步提高到368 g/L,是通气供苯法的5倍。证明通过发酵工艺的优化可以解决苯的毒害与苯作为反应底物在水相中需要有一定浓度之间的矛盾,获得较好的转化结果。     

子痫前期患者外周血单核细胞Toll样受体4检测及其意义

目的：通过检测子痫前期（PE）患者外周血Toll样受体4（TLR4）表达及其分泌促炎细胞因子的功能,探讨单核细胞TLR4 在 PE 发病过程中的作用。方法：选取22 例子痫前期患者（PE 组）和23 例正常孕妇（HP 组）作为研究对象。经知情同意后抽取4 mL 静脉血,肝素钠抗凝。流式细胞术（FCM）检测单核细胞TLR4表达;脂多糖（LPS）刺激单核细胞18 小时,Luminex 液相芯片检测培 养上清液中肿瘤坏死因子（TNF）-alpha、白细胞介素（IL）-6、IL-12P70 和IL-10 浓度;并分析PE 患者单核细胞TLR4 阳性频率与外周 血清细胞因子浓度的相关性。结果：与HP 组相比,PE 组单核细胞TLR4 阳性细胞频率（TLR4+：23.2 (18.4-44.3) % vs59.7 (19.8-79.7) %）和平均荧光强度（MFI：32.3(27.6-49.2)vs48.6 (32.4- 93.2）明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）;单核细胞经50 ng/mL LPS 刺激培养18 小时,PE 组上清液TNF-alpha(243.5± 15.2 pg/mLvs123± 81.3 pg/mL)、IL-6(3122.7 ± 534.2 pg/mLvs1380.4± 332 pg/mL)浓度明显高于HP 组,IL-10(84.2 ± 24.9 pg/mL vs164.5 ± 47.1 pg/mL)低于HP 组,差异均有统计学意义（P<0.05）;PE 患 者单核细胞阳性频率与外周血清中细胞因子TNF-alpha、IL-6 具有相关性（r=0.634、r=0.528,P<0.05）。结论：PE 患者外周血单核细胞 TLR4表达明显增加,并处于活化状态,分泌较多的促炎细胞因子IL-6 和TNF-alpha,参与子痫前期的疾病过程。因此,抑制单核细胞 TLR4表达可能是治疗子痫前期的新途经。     

志贺菌福氏2a入侵上皮细胞诱导表达的毒力相关基因筛选与鉴定

采用体内表达技术的研究策略筛选了志贺菌福氏2a侵入上皮细胞后诱导表达的基因,用基因突变技术进一步对它们的功能进行了鉴定.结果共筛选到13个胞内诱导基因,其中2个DNA甲基化相关基因、1个代谢相关基因、1个转录调控基因、3个插入成分、3个反义转录体、3个未知功能基因.突变体分析发现,3-甲基糖基化酶,柠檬酸裂合酶的编码基因和未知功能基因wcaJ的突变体在细胞和动物感染实验中都显示其存活增殖能力的降低,表明这些基因可能参与了志贺菌在上皮细胞内的存活和增殖.同时也表明,这种在上皮细胞内的存活增殖能力是志贺菌主要的毒力体现之一.但是,未知功能基因yaiC的突变体只在动物体内表现出明显的毒力缺陷,在上皮细胞内没有明显的增殖缺陷,这表明yaiC基因参与其他毒力作用机制.研究结果对深入认识志贺菌的致病机理有重要意义.     

生防菌Ⅲ-61抗真菌活性产物的摇瓶发酵

对生防链霉菌Ⅲ-61产生抗真菌活性物质的摇瓶发酵工艺进行了研究。利用正交试验设计优化了发酵培养基组分,其最适配方为黄豆粉1．5％,蛋白胨0．3％,蔗糖1．0％,淀粉1．3％,磷酸二氢钾0．02％,硫酸镁0．025％,氯化钠0．5％,配咸水溶液,调pH至7～7．4,加碳酸钙1％。通过单因素试验,筛选获得了最优培养条件组合：液体种龄24h,接种量5％～10％,500mL摇瓶培养基装量为80mL,摇床转速240r／min,培养温度31℃,发酵周期96～120h。此优化的发酵培养基与发酵条件的组合昕得菌株Ⅲ-61发酵液对主要靶标黄瓜灰霉病菌的抑菌圈直径达49．5mm,较优化前提高了45．59％。     

水稻体细胞培养中胚性细胞出现与IAA的关系

水稻体细胞培养中胚性细胞出现与ＩＡＡ的关系陈以峰１周燮２汤日圣２张金渝２梅传生１（南京农业大学农学系南京２１００９５）２（江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所南京２１００１４）关键词水稻,胚性细胞,ＩＡＡ,２,４二氯苯氧乙酸,２,３,５三碘...     

精氨酸82和精氨酸83在光驱质子泵细菌视紫红质和古紫质-4中的功能对比研究

古紫质-4(Archaerhodopsin-4, aR4)是一种存在于嗜盐菌Halobacterium species XZ515细胞膜上含有类胡萝卜素发色团菌红素(Bacterioruberin)的光敏受体蛋白,与细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin, bR)具有相似的三聚结构和光驱质子泵功能。尽管二者均为外向质子泵,但aR4表现为与bR不同的先摄取后释放的质子传输时序。位于bR胞外半通道的精氨酸82(Arginine 82, R82)充当着视黄醛键合区五边形氢键网络与质子释放簇(proton release cluster, PRC)之间的桥梁,不仅向胞外传递D85的质子化信息,同时调控PRC质子的释放和再质子化。R83作为aR4中的同源等位残基,其侧链取向与bR中的R82有所不同,而这一差异是否与其质子释放时序的不同有关目前尚未见报道。为此,本研究采用定点突变技术、原位紫外-可见光吸收光谱、闪光动力学光谱、酸碱滴定等技术手段,对比分析R83和R82在aR4和bR中的差异性作用。研究表明,R83和R82在aR4和bR中均起到质子受体与质子释放簇之间的“桥梁”作用,但是R...     

鲈-蟹混养模式下不同饵料对大口黑鲈生长和肠道菌群的影响

为研究鲈-蟹混养模式下冰鲜鱼(HB)、配合饲料(HS)和混合投喂(HH)等3种饵料投喂对大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长和肠道菌群影响,采用16S rRNA基因高通量测序技术,分析了不同饵料对大口黑鲈生长性能、肠道菌群结构和多样性的影响。结果表明,生长性能指标方面,配合饲料组试验鱼的末均重、体长和特定生长率均显著低于冰鲜鱼组和混合投喂组的(P<0.05),混合投喂组最后养成规格最大,生长速度也最快,但与冰鲜鱼组差异不显著(P>0.05)。多样性分析结果显示,配合饲料的投喂降低了大口黑鲈肠道菌群的丰富度和多样性。在肠道菌群结构方面,冰鲜鱼组的优势菌属主要为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)及发光杆菌属(Photobacterium),配合饲料组优势菌属为罗姆布茨菌(Romboutsia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)及醋杆菌属(Cetobacterium),而混合投喂组优势菌属则是克雷伯氏菌属(Klebsiella)、分...     

苏云金芽孢杆菌S1478-1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的Bt菌株S1478-1进行了特性鉴定,研究表明S1478-1分离株菌落形态和生长特征和Bt参照菌株HD73极其相似.16S rDNA序列分析表明,S1478-1分离株与其它B.thuringiensis、B.cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99%.分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130 kD大小的晶体蛋白.生物测定表明S1478-1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50卯值高达5.159 ×108cfu/mL.初步显示S1478-1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株.利用PCR-RFLP方法鉴定S1478-1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3 537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133.3 kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99%同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因.     

神经病理性疼痛不同性质疼痛患者血清BDNF、TLR4表达水平差异及其诊断价值分析

摘要 目的：分析神经病理性疼痛（NP）不同性质疼痛患者血清脑源性神经生长因子（BDNF）、Toll受体4（TLR4）表达水平差异及其诊断价值。方法：选取2021年5月～2022年5月本院收治的80例NP患者和100例健康体检者作为研究对象,将NP患者其纳入NP组,将健康体检者纳入对照组,并参照神经病理性疼痛量表（NPS）区分NP组患者的疼痛性质（钝痛20例,不适感28例,深部痛17例,体表痛15例）,分别检测两组患者和NP组不同性质疼痛患者的血清BDNF、TLR4表达水平,采用双变量Spearman相关性检验血清BDNF、TLR4与NP不同性质疼痛的相关性,同时建立多因素Logistic模型,分析NP不同性质疼痛的影响因素,并比较其诊断效能。结果：与对照组比较,NP组血清BDNF表达水平较低,TLR4表达水平较高（P＜0.05）;NP钝痛、不适感、深部痛、体表痛的血清BDNF、TLR4表达水平比较（P＜0.05）;血清BDNF与NP钝痛、不适感、深部痛、体表痛呈负相关性,血清TLR4与NP钝痛、不适感、深部痛、体表痛呈正相关性（P＜0.05）;Logistic多因素分析结果显示,BDNF、TLR4均是NP钝痛、不适感、深部痛、体表痛的独立危险因素（P＜0.05）;血清BDNF、TLR4和BDNF+TLR4对NP钝痛、不适感、深部痛、体表痛的ACU均＞0.70。结论：血清BDNF、TLR4与钝痛、不适感、深部痛、体表痛等性质的NP均存在一定关联,在诊断不同NP性质方面具有较高的敏感性和特异性,有利于为临床治疗提供参考依据。     

shASPP2 H22稳转肝癌细胞系的构建及ASPP2敲低对H22移植瘤小鼠血管生成的影响

摘要 目的：构建小鼠shASPP2 H22稳转肝癌细胞系,观察ASPP2敲低对血管生成的影响。方法：针对小鼠ASPP2基因设计了3个不同的shRNA干扰序列（Y18421,Y18422,Y18423）及1个对照序列（GL427NC2）,采用双酶切（Age Ⅰ和EcoR Ⅰ）及质粒连接构建重组质粒,使用菌落PCR和测序比对进行鉴定;使用293T细胞将各重组质粒包装慢病毒并测定滴度;将 shASPP2和对照慢病毒质粒转染H22细胞,采用流式细胞术测定转染效率;采用qRT-PCR、Western Blot法观察shASPP2慢病毒对H22细胞ASPP2的干扰效果;采用CCK8法观察ASPP2敲低对H22细胞增殖的影响;采用Western Blot法观察ASPP2敲低对H22细胞及上清VEGF表达和分泌的影响;采用细胞注射法建立小鼠ASPP2敲低H22细胞皮下移植瘤模型,游标卡尺法观察肿瘤体积大小,采用活体激光共聚焦观察肿瘤血管生成情况,采用Western Blot法观察肿瘤组织VEGF的表达。结果：双酶切、菌落PCR和测序鉴定结果表示各重组质粒构建成功;各重组质粒经慢病毒包装后,测定显示Y18421、Y18422、Y18423和GL427NC2慢病毒质粒的滴度分别为3.40×10⁸ TU/mL、4.08×10⁸ TU/mL、5.49×10⁸ TU/mL和1.7×10⁹ TU/mL;Y18421、Y18422、Y18423及GL427NC2慢病毒质粒转染效率分别为：86.2 %、69.6 %、60.8 %和76.9 %。与GL427NC2 H22细胞相比,Y18421 H22细胞的ASPP2 mRNA及蛋白的表达明显降低（P<0.01,P<0.05）;Y18421细胞在培养24,48,72 h后增殖速率显著增加（P<0.0001,P<0.001,P<0.01）;Y18421细胞及上清的VEGF表达显著升高（P<0.001,P<0.01,P<0.05）。与GL427NC2 细胞移植瘤相比,Y18421细胞移植瘤体积明显增大（P<0.05）,总血管长度显著增加（P<0.05）,VEGF蛋白的表达明显上调（P<0.05）。结论：小鼠shASPP2 H22稳转肝癌细胞系构建成功,ASPP2敲低可能通过上调VEGF的表达促进小鼠H22细胞移植瘤血管生成。