重组FN多肽CH50抑制黑色素瘤B16细胞体内转移的研究

目的研究重组纤黏连蛋白（FN）多肽CH50对小鼠黑色素瘤B16细胞体内转移的影响,以探讨CH50多肽抑制肿瘤转移的可能分子机制。方法体外培养黑色素瘤B16细胞,用荧光染料CFSE标记,接种脾脏后24h取脾、肝、肺做冰冻切片,观察肿瘤细胞在3种组织中的侵袭情况。从脾脏接种B16细胞,建立体内肿瘤转移动物模型,采用基于流体动力学的体内基因转染方法于小鼠体内表达CH50多肽,RT-PCR检测CH50mRNA在肝组织的表达,Western印迹检测CH50多肽的表达。通过比较原位肿瘤结节及转移结节在数量、大小、分布上的差异及检测原位肿瘤组织中MMP-2、MMP-9表达差异,观察CH50多肽的治疗效果。结果注射24h后即可在脾脏形成荧光结节。pCH510质粒通过尾静脉注射后,可在肝组织中检测到CH50mRNA及CH50多肽的表达。从脾脏接种B16细胞后第14天可在脾脏形成原发肿瘤,至第35天肝脏表面已形成转移瘤结节,成功建立了体内器官问（脾转肝）肿瘤转移动物模型。体内转染表达CH50多肽能抑制肿瘤生长、侵袭和转移,抑制原位肿瘤结节中MMP-2、MMP-9的表达。结论CH50多肽可以通过对MMP-2、MMP-9蛋白表达的抑制作用来抑制黑色素瘤B16细胞的成瘤能力和体内侵袭、转移能力。     

花青素单一成分矢车菊-3-O-葡萄糖苷抑制B16-F10细胞增殖和迁移的机理北大核心CSCD

本研究旨在探讨花青素单一成分矢车菊-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside, Cy-3-glu)对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10增殖和迁移的影响,并阐明相关机理。用不同浓度Cy-3-glu处理B16-F10细胞,采用CCK-8法检测细胞存活率,划痕法检测细胞迁移情况,流式细胞仪检测细胞周期,real-time PCR检测细胞周期相关基因的m RNA表达水平,Western blot检测p-AKT、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的相对表达水平,并用小动物活体成像仪检测B16-F10细胞在C57BL/6J小鼠体内的生长和迁移情况。结果显示,Cy-3-glu能明显抑制体外B16-F10细胞的生长(P <0.001)和迁移(P <0.01),使细胞周期阻滞在S期。Cy-3-glu作用后p-AKT (P <0.05)、N-cadherin和vimentin (P <0.001)表达水平显著下降,E-cadherin表达水平升高(P <0.05)。饲喂Cy-3-glu饲料的肿瘤模型C57BL/6J小鼠肿瘤大小和重量显著减小(P <0.05),肿瘤的转移水平也明显降低。以上结果提示,Cy-3-glu通过抑制PI3K/AKT信号、调节细胞黏附和迁移信号使B16-F10细胞周期停滞在S期,最终抑制其在体内和体外的增殖和迁移。     

双歧杆菌脂磷壁酸对B16荷瘤小鼠NK细胞受体NKG2D及其配体的影响

目的探讨双歧杆菌脂磷壁酸（LTA）对黑色素瘤B16荷瘤小鼠NK细胞受体NKG2D及其配体的影响。方法将黑色素瘤B16细胞接种于C57BL／6小鼠皮下,待触及肿块后于荷瘤小鼠皮下注射双歧杆菌LTA。采用MTT、流式细胞术（FCM）、RT-PCR方法分别检测经双歧杆菌LTA处理后B16荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性、NK细胞NKG2D受体蛋白表达以及肿瘤组织内Rae-1、H60 mRNA表达的变化。结果与对照组相比,经双歧杆菌LTA处理后,B16荷瘤小鼠的NK细胞杀伤活性增强（P〈0．05）,NK细胞受体NKG2D表达明显增加（P〈0．05）,肿瘤组织Rae-1、H60 mRNA表达上升（P〈0．05）,并具有浓度依赖性。结论双歧杆菌LTA能够增强B16荷瘤小鼠NK细胞的杀伤活性,其机制可能与上调NK细胞受体NKG2D的蛋白表达和肿瘤组织Rae-1、H60 mRNA的表达有关。     

紫外线b促进绵羊黑色素细胞中GPNMB和PMEL的表达

非转移性黑色素瘤糖蛋白b（glycoprotein non-metastatic melanoma protein b,GPNMB）及其同系物色素细胞特异性黑色素细胞蛋白（pigment cell-specific melanocyte protein,PMEL）对黑素体的形成和黑色素的生成具有重要的作用,而GPNMB和PMEL的功能还有待深入研究。本文旨在探索GPNMB和PMEL在不同毛色绵羊皮肤表达是否存在差异,确定紫外线b（UVB）对GPNMB和PMEL是否有影响。免疫组织化学结果表明,GPNMB在不同毛色绵羊皮肤的毛基质、内外毛根鞘、毛乳头等区域均有表达。Western印迹和qRT-PCR结果显示,黑色绵羊皮肤中GPNMB和PMEL表达量,高于白色绵羊皮肤。黑色素细胞经UVB照射后,GPNMB和PMEL的表达增高。UVB照射剂量为100 mJ/cm2时,黑色素细胞活性最高;单次UVB辐射后,GPNMB和PMEL mRNA表达量在72 h达到顶峰,两者的曲线变化趋势大致相同。UVB连续辐射后,GPNMB mRNA表达量在4 d达到顶峰,而PMEL mRNA表达量虽然在3 d升高,但且对GPNMB作用更明显。上述结果提示,GPNMB和PMEL在不同毛色绵羊皮肤存在差异性表达。UVB单次或者连续照射,均促进GPNMB和PMEL表达,且对GPNMB影响更显著。GPNMB和PMEL可能通过影响黑素体的成熟进而调节黑色素的生成。     

nm23 和S- 100 蛋白在B16 黑色素瘤模型鼠的表达和意义

目的：检测荷瘤鼠体内mn23（肿瘤转移抑制因子）与S-100蛋白的表达,探讨其表达与肿瘤发生、转移的关系。方法：将B16恶性黑色素瘤细胞人工植入C57小鼠背部皮下,制荷瘤鼠模型,取对照组和病变皮肤作免疫组化染色。结果：早期肿瘤nm23和S-100蛋白阳性表达的数密度和面密度明显增高,与对照组、晚期组比较差异显著（P〈0．05）。结论：在B16黑色素瘤荷瘤鼠nm23和S-100蛋白的表达与肿瘤的发生、转移呈负相关。     

采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1

 c DNA末端快速扩增 (RACE)技术是快速获得新基因 5′和 3′端未知序列的有效手段 .鉴于新报导的人肿瘤基因 MAGE家族成员之一 MAGE- D1的 c DNA序列不完全 ,从而拟用 RACE技术获得 MAGE- D1的全长 c DNA序列 .结果显示 ,MAGE- D1的 c DNA全长为 2 80 0个碱基 ,编码778个氨基酸 .同时对 RACE技术应用时的一些关键问题进行了讨论 .     

不同离心力对B16-F10细胞胞外微囊泡尺度、RNA和蛋白成分的影响

分析不同离心力对胞外微囊泡尺度、RNA和蛋白成分的影响。在分离纯化小鼠黑色素瘤B16-F10细胞胞外微囊泡过程中,采用12 000×g、100 000×g两种离心力提纯,利用纳米颗粒跟踪分析法分析微囊泡的尺度分布,透射电镜观察微囊泡超微结构,Western-blot鉴定微囊泡蛋白特征,BCA法分析微囊泡内容蛋白含量,毛细管电泳分析微囊泡RNA的性质和水平。结果显示,12 000×g组的平均粒径为233±93.5 nm,100 000×g组的平均粒径为175±74 nm(P0.05)12 000×g组微囊泡的蛋白浓度为3.942±0.427 g/L,100 000×g组微囊泡的蛋白浓度为2.428±0.113 g/L(P0.01),并表达exosome特异性蛋白Tsg101蛋白;12 000×g组微囊泡的RNA总量为22.662 0 mg/L,在258 nt时达到最高,100 000×g组微囊泡的RNA总量为3.280 1 mg/L,在283 nt时达到最高(P0.05)。因此,微囊泡尺度与离心力相关,不同尺度微囊泡所含蛋白、RNA不同。     

下调受体酪氨酸激酶样孤儿受体1表达对黑色素瘤B16F10生物学特性的影响

目的探讨下调黑色素瘤(melanoma)B16F10细胞中受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1, ROR1)分子表达对其生物学特性的影响,为治疗黑色素瘤筛选候选靶标奠定基础。方法①以慢病毒载体介导shRNA下调B16F10细胞中ROR1的表达,并检测其下调效果;②CCK8法检测B16F10, Scrambled和Lv-shROR1-B16F10等3组细胞的增殖能力,再通过划痕实验和Transwell实验检测3组细胞的迁移能力,最后用流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期;③将3组细胞接种到小鼠体内,观察小鼠的致瘤能力,并检测其致瘤效果。结果①经慢病毒感染后得到Lv-shROR1-B16F10和Scrambled两株细胞;②下调ROR1能够抑制细胞的增殖能力和细胞的迁移能力(P<0.05),使细胞停滞在G0～G1(P<0.05);③下调ROR1能抑制B16F10细胞的致瘤能力,瘤组织中ROR1的表达水平也降低(P<0.05)。结论 ROR1可参与黑色素瘤细胞的增殖、转移以及细胞的致瘤性,是一个有效治疗黑色素瘤的候选靶标。     

PVAX-MAGE-1基因疫苗延缓小鼠肝癌细胞H22腹水瘤和实体瘤的生长

为观察重组基因疫苗PVAX-MAGE-1的抑瘤效应,构建黑色素瘤抗原-1(melanoma antigen-1,MAGE-1)真核基因表达载体--PVAX-MAGE-1.以重组质粒免疫C57BL/6小鼠后,ELISA法检测表明,与对照鼠(PVAX-1和生理盐水注射小鼠)比较,免疫小鼠脾淋巴细胞上清液中的细胞因子IL-2和IFN-γ明显升高(P0.05);淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养证明,免疫小鼠外周血CD8+T细胞对靶细胞的特异性杀伤作用明显增强(P0.05).体内实验证明,PVAX-MAGE-1免疫C57BL/6小鼠,可显著延缓移植性H22腹水瘤及实体瘤在小鼠体内的生长.实验结果提示,重组基因疫苗PVAX-MAGE-1有明显的延缓肿瘤生长的作用,其抑瘤作用与提高T淋巴细胞IL和IFN表达,增强对肿瘤杀伤作用直接相关.     

靶向Ang2的RNAi慢病毒载体的构建及其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的影响

目的 构建携带促血管生成素2-小干扰RNA（Ang2-siRNA）慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的干扰作用.方法 将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒（pNL-EGFP）载体与pSilencer 1.0-U6启动子-促血管生成素2-小干扰RNA（pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA）重组质粒连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅰ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ）、加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅱ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ）慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白（pVSVG）包膜质粒和pHelper包装质粒共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Ang2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.0×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示：Ang2-siRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达（P＜0.05）.结论 成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示Ang2-SiRNA慢病毒载体能抑制恶性黑色素瘤细胞中Ang2 mRNA的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的干预实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据.