草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测

Fbxl5为F-box基因家族的一员,目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段,将其克隆入表达载体pET-28a,转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测,获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达,通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体,为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。     

蛋白芯片法在抗核抗体检测中的临床应用

目的：应用蛋白芯片法与欧蒙斑点法检测血清抗核抗体,并对其结果进行比较分析。方法：收集95例血清样本,其中45例确诊为自身免疫性疾病,阴性50例,同时采用蛋白芯片法和欧盟斑点法检测其抗核抗体（SSA、SSB、Sm、RNP、Scl—70、Jo-1、CENPB）,并对结果进行对比分析。结果：45例确诊病例中,蛋白芯片法阳性44份,欧蒙斑点法阳性41份,敏感度分别为97．78％和91．11％,特异度分别为98．95％和95．79％;按卡方检验进行结果统计,x^2=1．75,P〉0．05,差异无统计学意义。结论：蛋白芯片可用于临床检测自身免疫性疾病、治疗监测、疗效评估和预后判断。     

七鳃鳗Lja-SHP2分子鉴定、重组表达及免疫学研究

高等脊椎动物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由ptpn11基因编码,催化酪氨酸残基去磷酸化,与其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同调节机体内多种信号通路的信号传导。以往研究表明,SHP2在高等脊椎动物T细胞和B细胞的激活与信号转导过程中起着重要作用。为了研究无颌类脊椎动物日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中与SHP2同源的分子——Lja-SHP2在免疫应答反应中的作用,本研究通过PCR扩增获取其Lja-SHP2开放阅读框序列,并构建到原核表达载体pET-32a中,成功在大肠杆菌中实现重组蛋白表达并制备了其兔源多克隆抗体。用混合菌免疫刺激日本七鳃鳗后,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹方法检测了Lja-SHP2在日本七鳃鳗免疫相关组织中mRNA和蛋白水平表达谱。结果显示,混合菌免疫刺激后,Lja-SHP2 mRNA和蛋白表达在外周血白细胞和髓样小体中无显著变化,而在鳃组织中显著性上调(P<0.05),说明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要参与了鳃组织的免疫应答反应。为了进一步探究Lja-SHP2与淋巴细胞亚群免疫应答反应的相关性,本研究分别使用B细胞有丝分裂原脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和T细胞的有丝分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin,PHA)免疫刺激日本七鳃鳗。经LPS免疫刺激后,与对照组相比,白细胞中Lja-SHP2蛋白表达显著上调,鳃组织和髓样小体没有显著性差异表达;但经PHA免疫刺激后,与对照组相比,白细胞、鳃组织和髓样小体3种组织中Lja-SHP2均有上调,尤其在白细胞中上调最为显著,大约是对照组的2.5倍,说明Lja-SHP2参与了日本七鳃鳗由PHA介导的免疫应答反应。由于PHA能刺激日本七鳃鳗鳃组织中VLRA+淋巴细胞的活化,这表明Lja-SHP2可能参与了PHA介导的VLRA+淋巴细胞亚群的免疫应答反应。上述研究结果为进一步探索Lja-SHP2在七鳃鳗免疫应答过程中的功能奠定了基础,也为揭示SHP2分子家族的系统发生及探索高等脊椎动物适应性免疫系统的早期发生及其进化历程提供一定的线索。     

苦荞黄酮-3-羟化酶截短体的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备苦荞黄酮-3-羟化酶的多克隆抗体,该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞黄酮-3-羟化酶基因截短体(truncated Flavanone-3-hydroxylase,TrF3 H)序列为基础,采用PCR扩增F3 H的截短序列编码区(TrF3 H),构建了原核表达载体pET47b-TrF3 H,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行诱导表达,将经钴离子螯合层析柱纯化后的目的蛋白切胶回收后制备了高效价的多克隆抗体。结果表明:pET47b-TrF3 H在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中以包涵体的形式高效表达。蛋白质印迹显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的黄酮-3-羟化酶蛋白在苦荞的未成熟种子中大量表达。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨F3H在苦荞中功能奠定了基础。     

贯叶连翘提取物对小鼠免疫性心肌炎的作用

目的:探讨贯叶连翘提取物对小鼠免疫性心肌炎的治疗作用。方法:猪心肌球蛋白免疫BALB/C小鼠,建立免疫性心肌炎模型。结果:贯叶连翘提取物能抑制小鼠脾脏组织,降低外周血T淋巴细胞CD4/CD8比例和血清肌球蛋白自身抗体滴度,减轻心肌内淋巴细胞浸润。结论:贯叶连翘提取物对小鼠免疫性心肌炎有治疗作用。     

蛋白体黏膜佐剂的研究进展

通讯作者：蛋白体是脑膜炎球菌外膜蛋白形成的疏水性的毫微粒囊泡状结构,可以安全有效的提高脂多糖,蛋白和多肽等多种抗原疫苗的免疫原性。迄今为止,很多研究显示蛋白体黏膜佐剂的优势潜能。作者检索了近年来国内外关于蛋白体作为免疫佐剂的相关文献,并进行分析、归纳。本文综述了蛋白体的结构、作用机理以及国内外作为黏膜佐剂的研究进展。     

双歧杆菌四联活菌片对肝硬化白发性细菌性腹膜炎患者肠黏膜屏障和炎症因子的影响

目的探讨双歧杆菌四联活菌片对肝硬化自发性细菌性腹膜炎（SBP）患者肠黏膜屏障和炎症因子的影响。方法选择乙肝后肝硬化SBP患者68例,分为治疗组和对照组。两组患者均予以低盐饮食、护肝利尿、补充白蛋白和抗感染等基础治疗。治疗组在此基础上予以双歧杆菌四联活菌片口服,1．5g／次,3次／d,连用6周。结果治疗6周后,两组血浆内毒素、PCT和尿L／M比值比较均有明显下降（对照组比较P〈0．05,或治疗组比较P〈0．01）,且治疗组下降幅度明显优于对照组（P〈0．05）;两组血浆TNF-α、IL-6和IL-10水平均有明显下降（对照组比较P〈0．05,或治疗组比较P〈0．01）,且治疗组下降幅度明显优于对照组（P〈0．05）。治疗组临床总有效率明显高于对照组（χ2=8．17,P〈0．01）,治疗期间未发生严重的药物不良反应。结论双歧杆菌四联活菌片治疗肝硬化SBP患者具有较好的临床疗效及安全性,对患者肠黏膜屏障功能具有良好保护和改善作用,并能下降血浆TNF—α、IL-6和IL-10水平,具有辅助治疗肝硬化作用。     

消化道屏障与树突状细胞免疫研究进展

肠相关淋巴组织在防御病毒、细菌、寄生虫等有害物质入侵中发挥着重要作用,是消化道屏障的组成部分,其中肠道树突状细胞尤为重要,作为目前所知的机体内功能最强的专职性抗原呈递细胞,在肠道内,树突状细胞不但能对病原菌产生免疫应答,还能对肠腔内的正常菌群和各种食物蛋白产生免疫耐受,因此了解树突状细胞的功能及相关作用机制有着重要意义.现就对树突状细胞的生物学特性,以及其在肠道免疫中的作用进行综述.     

两步串联层析法纯化抗TNF-α单克隆抗体北大核心CSCD

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。