VPA1500基因缺失对副溶血弧菌生物学特性和致病性的影响

Ⅵ型分泌系统（T6SS）是细菌的一种毒力因子分泌系统,通过分泌蛋白参与调控细菌的环境适应性和毒力。副溶血弧菌具有两个T6SS系统（T6SS1和T6SS2）。[目的] 前期通过差异蛋白质组学技术筛选到副溶血弧菌T6SS1相关的分泌蛋白,本文选择其中的VPA1500为研究对象,研究其基因缺失对副溶血弧菌的生物学特性及致病性的影响。[方法] 利用同源重组技术构建缺失株ΔVPA1500和互补株CΔVPA1500;分析各菌株生长特性、在体外的细菌竞争能力、运动性、细菌鞭毛相关基因的转录水平及生物被膜形成能力的差异,比较各菌株对细胞毒性、小鼠毒力、动物组织载菌量以及组织病理学变化的影响。[结果] 与野生株相比,VPA1500基因缺失后不影响细菌的生长能力、生物被膜形成能力和群集运动,然而ΔVPA1500的浮泳运动能力显著下降;进一步通过透射电镜观察和实时定量PCR检测发现,VPA1500缺失影响副溶血弧菌鞭毛的形成;细菌竞争实验显示缺失VPA1500基因降低了副溶血弧菌野生株体外对大肠杆菌的杀伤能力;ΔVPA1500对细胞毒性、小鼠毒力以及在动物组织的定殖能力均显著低于野生株,互补株毒力基本恢复至野生株水平;组织病理学结果进一步表明,缺失VPA1500基因能够降低副溶血弧菌对小鼠组织的损伤。[结论] VPA1500参与副溶血弧菌的体外细菌竞争能力、浮游运动能力和致病性。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB,常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种,弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌（Vibrioatginolyticus）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98％,相互间不能区分;HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98％以上,而与所有其它弧菌的相似性不到92％。结合表型和分子特征的鉴定结果,菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。     

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的表型克隆与序列分析

哈维氏弧菌是引起大黄鱼疾病的主要致病菌之一,胞外蛋白酶是哈维氏弧菌GYC1108-1的主要致病因子。利用表型克隆技术,用Sau3AⅠ将提取的哈维氏弧菌基因组DNA酶切成短片段,纯化回收1-5 kb的片段与BamH I酶切的pUC118在T4连接酶的作用下进行连接,并转化感受态细胞TG1,在含0.5%脱脂奶和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选胞外蛋白酶阳性株,命名为YZ。测定阳性株YZ的胞外蛋白酶活性,并对阳性株的重组质粒的插入片段进行序列测定,分析开放阅读框,确定胞外蛋白酶基因编码区。发现蛋白酶基因的ORF编码531个氨基酸,在起始密码子ATG上游存在一个核糖体结合位点(SD),其上游的启动区与大肠杆菌的σ70启动区和枯草芽孢杆菌的启动区高度同源。在终止子(TAG)下游,存在两个反向重复序列,为推导的2个转录终止子。哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆与诠释为哈维氏弧菌致病机理和疫苗的开发奠定了基础。     

toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧茵的TaqMan实时荧光PCR方法.特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧茵,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原茵没有交叉反应:灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%:所制作的标准曲线在2.5 × 101～2.5 × 106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血孤菌进行准确的定量分析.结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好,灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h.是快速检测副溶血弧菌的有效手段.     

凡纳滨对虾细菌性病原的分离鉴定和耐药性研究

从5批患病的凡纳滨对虾分离细菌性病原,共分离纯化了50株细菌,随机选择形态差异的11株进行16S rDNA基因测序。测序结果表明,这11株菌主要分布在节杆菌属、弧菌属、芽胞杆菌属、微小杆菌属和希瓦氏菌属。对其中2株弧菌进行16S rDNA基因系统进化树分析,发现1株A1-1可能为Vibrio parahaemolyticus(副溶血性弧菌),而另外1株菌A2-3可能为Vibrio rotiferianus(半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌)。形态和生理生化鉴定表明A1-1符合副溶血性弧菌的基本特征,可能是副溶血性弧菌中的一个型。人工感染实验表明A1-1对金鲫鱼具有明显的致病性,1×10~6 CFU感染剂量时能使80%金鲫鱼死亡。耐药性分析表明A1-1对土霉素、红霉素有较强的抗药性,而对链霉素、新霉素、四环素和氟本尼考均表现一定的敏感性。     

南方九孔鲍鲍苗掉板病原菌的药敏测定*

为提高鲍鱼培苗的成活率,对分离自广东汕尾一养殖场鲍苗掉板池中(包括水、藻膜和变白鲍苗)的、经回归感染试验证明为致病菌的菌株进行了鉴定和药物敏感性测定。API鉴定表明,这些致病菌株由Vibrio alginolyticus,Vibrio cholerae,Vibrio parahaem olyticus等组成,其中弧菌17株,约占总分离菌株的50%,而溶藻弧菌则为弧菌的优势菌株,有11株,约占弧菌总数的70%。药敏结果显示,绝大多数菌株对链霉素、红霉素和庆大霉素敏感;相反,四环素和新生霉素则对它们没有作用或     

蓝莓提取物对副溶血性弧菌的抑制作用

本文以北高丛蓝莓中的栽培品种埃利奥特为原料,通过L16(43)正交实验,分析比较了16种提取物对副溶血性弧菌的抑菌效果及各提取物的pH值.结果表明:在30℃下,以65％乙醇(w/w)为溶剂,超声提取25min为最优提取条件.采用此条件得到的提取物具有最低的pH值,在浓度为100和40 mg/mL时,对副溶血性弧菌的抑菌率分别达100％和81.3％.     

中华须鳗嗅觉器官形态学观察

利用光学显微镜和扫描电镜观察了10尾不同体长中华须鳗嗅觉器官的结构.结果表明:中华须鳗嗅囊呈楔型;嗅囊膜和嗅囊腹面的透明膜共同围成嗅囊腔;嗅囊长径与眼径的平均比值为2.2倍;每侧嗅囊嗅板数变化范围在30～44之间;嗅板远轴端有一纤毛和嗅孔密集的舌状游离突;嗅板上皮纤毛密集,纤毛细胞表现为3种类型:纤毛感觉细胞、纤毛非感觉细胞和微绒毛感觉细胞;纤毛非感觉细胞和微绒毛细胞也出现在嗅囊壁.嗅板上大量的纤毛表明,中华须鳗嗅囊的水动力机制应属嗅板纤毛搅动型(isosmates).除观察到嗅囊壁表面有两种类型的微嵴外,还首次在嗅板上观察到一种呈荸荠状的杆状细胞.     

脱硫弧菌SRB7对重金属铬Cr(VI)还原特性

利用化工厂污泥废水中分离到的一株耐酸脱硫弧菌(Desulfovibrio SRB7),对不同pH,温度、碳源、菌废比等条件下SRB7还原Cr(VI)能力进行研究.并从H2S还原途径、电子传递途径以及胞外聚合物(EPS)吸附途径研究SRB7菌体整体去除Cr(VI)的特性.结果表明:当Cr(VI)起始浓度为50 mg/L时,pH 7.5,培养温度36℃,碳源为乳酸钠,混合菌液和Cr(VI)溶液的菌废比为1:5(V/V)能获得很好的还原效果.在SRB7去除Cr(VI)的特性中,吸附途径对Cr(VI)的去除几乎不起作用;电子传递途径在Cr(VI)的还原过程中不占优势,24 h去除率为51.42%;而H2S途径在Cr(VI)的还原过程中占主导地位,24 h去除率为78.02%.