表皮生长因子受体基因突变检测方法改进及初步临床验证

目的:改进现有的检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的荧光PCR法并开发出新的试剂盒,将其与直接测序法和ARMS法进行对比,验证该试剂盒用于临床诊断的敏感性、特异性和准确性。方法:收集2013年6月至2015年8月手术确诊的141例非小细胞肺癌(NSCLC)的石蜡包埋组织标本。采用盲法分别使用直接测序法、ARMS法和新试剂盒检测EGFR突变,比较新试剂盒与其他两种检测方法的差异,结果不一致时采用三种方法分别重复检验一次。结果:三种方法检测成功率均为100%,新试剂盒与直接测序法测得结果完全一致的比率达75.9%(107/141),在直接测序法测得的96例突变阳性中,92例在新试剂盒检测中得到验证(95.8%)。而直接测序法显示突变阴性的45例中,新试剂盒检测发现了23例突变阳性,两种检测方法的结果存在统计学差异(x2=40.745,P0.05)。与直接测序法进行比较,新试剂盒检测EGFR突变的敏感性、特异性分别为95.8%、48.9%,阳性预测值、阴性预测值分别为80.0%、84.6%,检测准确度为80.9%。以ARMS检测法为金标准,新试剂盒测得结果完全一致的比率达84.4%(119/141),两者的一致性比较好(K=0.749,P0.05),敏感性、特异性分别为94.1%、86.4%。结论:改进后EGFR基因突变检测的试剂盒在技术上较好地控制了检测结果的假阳性和假阴性,该检测方法较直接测序法具有更好的敏感性和准确性,与现有的ARMS法一致性较高。     

一个α,β地中海贫血复合家系β珠蛋白基因的进一步研究

 前文~[1]曾报道广西一个α,β地中海贫血复合家系的血红蛋白组成及α珠蛋白基因分析结果,并讨论了各成员可能的β珠蛋白基因结构情况。本文利用先进的PCR即基因扩增技术,结合特异寡核苷酸探针斑点杂交及扩增后直接测定DNA序列的技术,进一步研究并彻底搞请了该家系各成员的β珠蛋白基因结构情况。结果显示:母亲及两个弟弟都是编码子41—42TTCT四个碱基缺失造成框架位移所致β地中海贫血的杂合子。父亲与先证者的β基因均属正常。前三个成员均为α地贫复合β地贫,其α与β珠蛋白链合成的不均衡状态得到改善,贫血症状也明显轻。     

促髓细胞分化的锌指基因单向PCR扩增直接测序的研究

锌指基因是一种造血调节基因,编码锌指结构蛋白,主要在髓细胞中表达,促进髓细胞分化,在急性早幼粒白血病维甲酸治疗中,促使病情缓解。本文报道了我们从基因分子上研究锌指基因作用中,探索并建立了单向聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增特定单链ＤＮＡ,直接测序的新方法。它能产生质和量均佳的单链ＤＮＡ,无需纯化即可直接用于测序,使复杂的测序研究简便易行,可在２,３天内完成。这种单向ＰＣＲ扩增特定单链ＤＮＡ直接测序的方法,经对锌指基因的ｃＤＮＡ测序,得到验证。此法不仅适用于疾病研究中的ＤＮＡ测序,还可制各单链ＤＮＡ探针,更利于基因结构组成的研究。     

肿瘤患者PICC置管继发皮肤损害处的菌群分析

目的 探讨肿瘤患者外周插入中心导管（peripherally inserted central catheters,PICC）继发皮肤损害处的菌群组成。方法 选择2019年12月至2021年6月我院收治并接受PICC置管的肿瘤患者62例。其中31例患者PICC置管处继发皮肤损害,纳入PICC组;31例患者PICC置管处未发生并发症,纳入对照组。采集两组患者PICC置管处的皮肤微生物并进行16S rRNA基因测序和分析。采用Mann-Whitney U检验分析两组对象皮肤微生物的丰度差异。采用随机森林分类模型对最佳PICC组分类单元集进行变量重要性分析,并且分析皮肤微生物群对PICC置管处继发皮肤损害的鉴别价值。结果 共鉴定出15 243个可操作分类单元（operational taxonomic units,OTUs）,鉴定水平为99.3%。移除罕见OTU后,保留1 958个OTU。分析表明PICC组和对照组之间皮肤微生物丰度存在显著差异,其中有7个菌群变化最显著。Staphylococcus aureus在PICC组中的丰度显著增加,而代表严格厌氧菌的Burkholderia sp....     

幽门螺杆菌相关胃炎患者唾液菌群的研究

目的 探究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H. pylori）相关胃炎（HpAG）患者和健康人群的唾液菌群特征,找出HpAG患者与无H. pylori感染人群唾液菌群之间的差异。方法 选取符合纳入标准的门诊及住院HpAG患者30例（HP组）,无H. pylori感染者30例（HC组）,收集2组人群唾液标本,通过PCR法扩增16S r RNA基因V3―V4区,经过高通量测序后,对测序数据处理后进行ASV注释、群落结构及多样性分析。结果 群落结构分析表示HpAG患者有其特征性的菌群结构。门水平上,HC组与HP组患者均以拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteriota）和放线菌门（Actinobacteriota）为主要优势菌门。与HC组比较,HP组患者唾液菌群中Fusobacteriota相对丰度显著增加（t=2.01,P<0.05）。属水平上,HC组与HP组患者均以普雷沃菌属（Prevotella）、奈瑟菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophi...     

生物有机肥对菠萝心腐病及根际土壤细菌群落的影响

【目的】探明施用生物有机肥对菠萝心腐病的防控效果及对根际土壤微生物的影响。【方法】本研究采用高通量测序技术,综合分析不同施肥措施根际土壤微生物细菌群落多样性及群落特征。【结果】相比常规施肥处理(CK)和普通有机肥处理(YJ),生物有机肥处理KN (羊粪有机肥+泥炭土+枯草芽孢杆菌)和生物有机肥处理KY (羊粪有机肥+椰糠+枯草芽孢杆菌)均能显著降低菠萝心腐病的发病率,且KN处理的防控效果最佳。生物有机肥(KN、KY)施入后土壤细菌α多样性指数高于CK和YJ处理,并形成了明显不同的细菌群落结构。与CK相比,生物有机肥KN处理显著提高了拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)的丰度,KY处理中的酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)丰度显著增加;属水平上,生物有机肥中的蔗糖伯克霍尔德菌属(Paraburkholderia)和黄杆菌属(Flavobacterium)丰度均显著提升。方差分区分析(variance partitioning analysis, VPA)表明,土壤化学性质(36.29%)对细菌群落影响最大,其中土壤速效钾和有机质是影响土壤细菌群落的关键因子,此外发病率(22.53%)和肥料偏生产力(16.42%)也是影响土壤细菌群落的重要因子。【结论】施用生物有机肥(KN、KY)能改变根际土壤细菌群落结构,降低发病率,对菠萝根际土壤生态系统稳定与健康具有重要意义。     

法尼醇X受体激动剂细胞筛选体系的建立与优化

本研究旨在建立一种基于双荧光素酶报告基因检测体系的法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)激动剂细胞筛选体系,以满足对FXR激动剂先导化合物的高通量筛选。通过在报告基因质粒pGL4-luc2P-Hygro中的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Luc)基因上游克隆并插入来自FXR靶基因的FXR反应元件(FXR response element,FXRE)片段,构建用于筛选FXR激动剂的报告基因质粒,并结合海肾荧光素酶内参质粒,建立能够有效反映药物对FXR激动效应的双荧光素酶报告基因细胞检测体系。通过一系列优化实验,比较了过表达RXR、鼠源和人源FXR、不同的FXRE片段、FXR过表达质粒与报告基因质粒的混合比对筛选体系诱导效率和灵敏度的影响。根据上述结果,最终确定了优化条件,优化后体系Z因子达到0.83。本研究建立了一种用于FXR激动剂筛选的改良的基于双荧光素酶报告基因检测体系的细胞筛选体系,其主要特征在于,使用多段FXR靶基因上的FXRE片段叠加组成一种新型的增强型FXRE元件,而非传统的反向重复序列-1 (inverted repeats...     

二氢杨梅素对抗生素应激小鼠血清抗氧化性和肠道微生物多样性的影响

【背景】二氢杨梅素(dihydromyricetin, DMY)是一类存在于藤茶中的主要黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎等功能,其药用价值受到广泛关注,但其在生物体内的生物活性及肠道中的分解代谢机制尚不清楚。【目的】探究二氢杨梅素对抗生素应激下小鼠的血清抗氧化性和肠道微生物多样性的影响。【方法】将小鼠分为对照组、抗生素组、抗生素+二氢杨梅素组,检测各组小鼠血清中的抗氧化指标,利用高通量测序分析组间肠道微生物多样性的差异,通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)验证特定菌群组间的相对丰度差异。【结果】二氢杨梅素显著提高了抗生素应激小鼠血清中过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutataione peroxidase, GSH-PX)活性(P<0.05),显著降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(P<0.05),催化一氧化氮(nitric...     

攀西高原不同轮作制度下土壤固氮微生物nifH基因多样性与群落结构特征

[背景]关于高原生境轮作制度对土壤固氮微生物群落组成及多样性的影响研究尚少。[目的]深入认识攀西高原不同轮作制度对农田土壤肥力及土壤固氮微生物nifH基因群落结构与多样性的影响,以期建立合理的轮作制度。[方法]以凉山州冕宁县不同作物轮作制度[包括光叶紫花苕-烤烟(分轮作15年和20年两种,分别为G1和G2)、苦荞-烤烟(KQ)、大麦-烤烟(DM)和撂荒(CK)]的土壤为研究对象,通过化学分析和Illumina MiSeq技术,对土壤理化性质、土壤固氮微生物nifH基因多样性及群落组成进行分析。[结果]撂荒土壤全氮、铵态氮、硝态氮、有机碳和含水量最显著(P<0.05)。KQ轮作下土壤有效磷和速效钾分别提高了43.0%和2.60%,而DM轮作下的土壤理化性质均下降。土壤固氮酶活以撂荒土壤最高,G2轮作最低。土壤固氮微生物nifH基因多样性以G1轮作最高、G2轮作最低,门水平上以变形菌门(Proteobacteria)是优势共有nifH基因类群,相对丰度占群落的63.0%-92.4%;属水平上,偶氮氢单胞菌属(Azohydromonas)是不同轮作制度下的优势物种,慢生根瘤属(Brad...     

绒山羊源大肠杆菌噬菌体φPTK的分子生物学特性及对小鼠大肠杆菌感染的防治效果

【背景】抗生素耐药问题是影响人类及养殖业健康的重要因素,噬菌体能特异性裂解细菌,成为抗生素替代品研究热点,是解决抗生素耐药难题、促进养殖业健康发展的新途径。【目的】通过研究绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体φPTK (phage target of K1)的分子生物学特性,同时利用小鼠感染模型研究φPTK对小鼠大肠杆菌感染的防治效果,为绒山羊大肠杆菌病的防控提供新策略。【方法】用聚乙二醇-氯化钠(PEG 8000-NaCl)浓缩φPTK后,采用透射电子显微镜观察其超微形态结构;运用苯酚-氯仿法提取φPTK核酸后通过Illumina HiSeq高通量测序分析其全基因组结构,使用Mauve比较基因组学分析,通过MEGA绘制噬菌体进化树;通过构建小鼠感染模型分析φPTK对小鼠感染大肠杆菌的防治效果。【结果】透射电镜显示φPTK头部为正多面体形,直径90 nm,有长约112 nm、直径约18 nm的可收缩长尾;φPTK基因组全长169 688 bp,GC含量37.72%,有264个开放阅读框,含穿孔素-裂解酶(holin-lysin)裂解系统,有抗穿孔素蛋白和裂解抑制辅助蛋白,未发现抗生素耐药基因和毒力基因;比较基因组分析表明,φPTK为一株新的绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体;小鼠大肠杆菌感染前和感染后分别使用φPTK进行预防和治疗的试验表明,未使用φPTK的阳性对照组小鼠全部死亡,预防组和治疗组小鼠存活率分别为80%和60%。【结论】噬菌体φPTK是一株能够在小鼠大肠杆菌感染中具有较好预防效果的有尾噬菌体目(Caudovirales)肌尾噬菌体科(Myoviridae)绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体,本研究为绒山羊噬菌体生物制剂的创制奠定了基础。