嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman Pif1解旋酶的异源表达与解旋反应特性

【目的】原核表达与纯化源自嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman的Pif1解旋酶,从而探究其解旋反应特性。【方法】将重组载体pET21a-AnaPif1-TEV/SUMO导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行Ni-NTA亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析等一系列纯化手段;再利用快速停留监测技术系统地研究Ana.Pif1的解旋反应特性,包括解旋极性、最佳ATP浓度、最佳金属辅因子、最佳解旋温度以及解旋复制中间体DNA的底物特异性。【结果】通过异源表达与纯化,获得了无任何标签序列、分子量59 kDa的Ana.Pif1蛋白,纯度达97%,产率为9.5 mg/L。本研究首先验证Ana.Pif1具有5'-3'的解旋极性,并发现其解旋反应最佳ATP浓度为2 mmol/L,其最佳二价金属辅因子为Mg~(2+),最适反应温度为55°C。解旋复制中间体的底物特异性显示,Y-S型复制叉的解旋速率最高,为0.127s~(–1);而12 nt-bubble底物的解旋幅度最大,达到78.8%;暗示这些底物可能是Ana.Pif1的天然底物。【结论】本文首次较为系统地分析了Ana.Pif1解旋酶的解旋反应特性,为阐明此类嗜热细菌Pif1解旋酶的分子作用机制奠定了基础。     

马铃薯HSP17.7基因的克隆及其对高温逆境的响应

热激蛋白和植物对高温的响应密切相关,同时在植物生长发育调控和逆境抵抗等方面具有重要作用。该研究克隆了马铃薯热激蛋白基因StHSP17.7(GenBank登录号为XP_006350804.1),对其全长cDNA序列进行了相关生物信息学分析,并利用qRT-PCR分析StHSP17.7基因在高温胁迫下的差异表达特性。结果显示:(1)StHSP17.7全长755bp,包含465bp开放阅读框,编码154个氨基酸。(2)StHSP17.7分子质量约为17.62kD,等电点7.91,为亲水性蛋白,C端含有保守序列Ⅰ和Ⅱ组成的ACD结构域,属于典型的sHSPs家族成员。(3)系统进化分析发现马铃薯小分子热激蛋白归为12个亚家族,其中StHSP17.7与马铃薯HSP17.6蛋白亲缘关系较近,属于小分子热激蛋白C的Ⅰ类家族成员;基因结构分析显示,在马铃薯48个sHSP基因中,StHSP17.7基因不含内含子,含1个内含子的基因有23个,占47.9%。(4)qRT-PCR分析显示,高温能够快速诱导StHSP17.7基因表达,且基因表达量呈爆发式变化,在24h达到最高值。研究表明,StHSP17.7基因明显参与了马铃薯对高温的响应。     

褪黑素预处理对高温下猕猴桃幼苗抗氧化能力的影响

为了探明外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃幼苗耐热性的影响,以盆栽‘秦美’猕猴桃幼苗为材料,进行根灌褪黑素溶液和45℃高温胁迫处理,并测定相关抗逆生理指标。结果表明：(1)与高温对照相比,褪黑素预处理显著降低了猕猴桃幼苗叶片相对电导率和丙二醛含量,提高了脯氨酸含量以及过氧化氢酶和过氧化物酶活性,且褪黑素溶液浓度在100~200 μmol·L^-1时效果较好。(2)褪黑素预处理显著增加了叶片中总酚、总黄酮和总黄烷醇含量,且幼苗的抗氧化能力(ABTS法、FRAP法和DPPH法)在胁迫过程中显著高于高温对照。研究认为,外源褪黑素可以通过提高植株体内抗氧化酶活性,非酶抗氧化物质如酚类物质和类黄酮物质含量以及渗透调节物质含量来增强植物的抗氧化能力,从而有效缓解高温对于猕猴桃幼苗的伤害,增强猕猴桃幼苗的耐热性。     

浅表层水稻土N2O消耗能力及其与N2O还原微生物的耦合关系

土壤不仅能够产生、排放温室气体N_2O,还具有截留、吸收、转化N_2O的能力。土壤消耗N_2O已经成为很重要的一种降低大气N_2O浓度的途径,但目前关于土壤N_2O消耗过程及其微生物调控机制的系统研究较为缺乏。试验以浅表层水稻土柱(0—5 cm)为研究对象,通过外源添加N_2O气体研究N_2O迁移通过淹水土柱的动态过程,以及N_2O消耗能力与氧化亚氮还原酶基因丰度变化和其他土壤养分含量变化的联系,揭示浅表层水稻土N_2O消纳量与N_2O还原微生物之间的耦合关系。结果显示,淹水厌氧条件下5 cm土壤深度外源添加的N_2O迁移通过浅表层土柱后,仅有7.17—9.80%部分逸散出土表,表明0—5 cm淹水水稻土层具有极强的N_2O截留能力(90%以上)而减少N_2O净排放量。排放出土表的N_2O也可被淹水土柱继续吸收消耗,且吸收转化速率随N_2O浓度增加而大幅提高,最高可达到3896.75μg N m~(-2) h~(-1)。与此同时,土壤DOC含量大量消耗,含nosZⅠ基因的反硝化微生物数量显著增长(P0.01),而nosZⅡ基因丰度的无显著变化。说明高浓度N_2O添加能够促进淹水土壤N_2O吸收消耗能力,此刺激作用可能主要由含nosZⅠ基因的N_2O还原微生物进行调控。浅表层土壤强大的N_2O吸收消耗功能可进一步深入系统研究,为实践温室气体减排提供理论基础。     

基于CERES-Rice模型的湖南省一季稻极端高温损失评估及适应性措施

以湖南省4个农业气象站点的一季稻为研究对象,基于1990-2012年逐日气象数据,精细的土壤以及田间管理记录,分析了过去23年极端高温的变化趋势,并利用校准后的CERES-Rice模型评价了高温热害的致损率,着重探讨了不同的适应性措施对缓解高温热害的作用,以期提出科学合理的减灾措施来保障我国的粮食安全。结果表明：（1）CERES-Rice能很好地捕捉本研究区不同天气和管理条件下的水稻物候期和产量,除桑植站开花期外,其余各参数的模拟误差均小于10%。（2）一季稻生育期内极端高温频发且在本世纪有增强趋势,灾损率由高到低依次为古丈 > 桑植 > 怀化 > 靖州,分别为10.4%,8.2%,7.5%和4%。随着气候变暖的加剧,一季稻生产将面临着日趋严重的高温热害风险。（3）选用耐高温品种产量最大可提升29.8%,但在极端高温年份,提高品种高温抗性的方法收效甚微。调节播种期会导致-25%-20%的产量波动,其中提前10 d或5 d种植均可缓解极端高温的危害。增加灌溉的贡献为1%-8%,其中6-8 cm灌水量效果最佳。极端高温期间增施氮肥的贡献稳定且显著,平均增产2%-20%,80-100 kg/hm²的施氮量能带来较为理想的避热增产效果。     

高温高湿胁迫及恢复对番茄快速荧光诱导动力学的影响

为了研究高温高湿复合胁迫对番茄的影响,以番茄品种“金冠五号”(Jinguan 5)为试材,于2018年6-9月在南京信息工程大学农业气象试验室进行温度、相对湿度与处理天数三因素正交试验,温度设置4个水平(昼温/夜温),即32℃/22 ℃、35℃/25℃、38℃/28 ℃、41℃/31℃,空气相对湿度设置3个水平为50%±5%、70%±5%、90%±5%,4个持续时间(3、6、9、12 d),以28℃/18℃、50%~55%环境下处理的番茄幼苗为对照(CK),测定不同处理下番茄叶片光合参数和快速荧光诱导动力学参数.结果表明:在日最高32~41℃范围内,随着温度升高,番茄光饱和点(LSP)、表观量子效率(AQE)、最大净光合速率(Pmax)、最大光化学效率(Fv/Fm)、光合性能指数(PIabs)、综合性能指数(PItotal)、用于电子传递的量子产额(φEo)、用于还原PSI受体侧末端电子受体的量子产额(φRo)、用于电子传递的光能(ET0/CSm)和有活性的反应中心数量(RC/CSm)均有所降低,快速叶绿素荧光诱导曲线发生变化,J、I、P相降低,且AK小于0.在高温环境下,70%湿度处理的LSP、AQE、Pmax、Fv/Fm、PIabs PItotal、φEo、φRo、ETo/CSm、RC/CSm等指标显著高于50%和90%湿度处理.不同天数处理和恢复期间各指标无显著性差异.研究表明:高温胁迫破坏了番茄幼苗光系统的结构和功能,在超过日最高35℃的环境中,适当增加空气相对湿度至70%,可稳定光合反应中心,缓解高温胁迫对植物光合系统的伤害.     

外源褪黑素与钙离子互作对高温胁迫下黄瓜幼苗过氧化伤害的缓解效应

为了探明褪黑素(MT)和钙离子(Ca²⁺)在调控植物耐热性中是否存在互作关系,以黄瓜幼苗为试材,分析了内源MT和Ca²⁺对高温胁迫的响应;并通过叶面喷施100 μmol·L^-1 MT、10 mmol·L^-1 CaCl₂、3 mmol·L^-1乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA,Ca²⁺螯合剂)+100 μmol·L^-1 MT、0.05 mmol·L^-1氯丙嗪(钙调素拮抗剂,CPZ)+100 μmol·L^-1 MT、100 μmol·L^-1氯苯丙氨酸(p-CPA,MT合成抑制剂)+10 mmol·L^-1 CaCl₂和去离子水(H₂O),研究高温下(42/32 ℃)外源MT和Ca²⁺对黄瓜幼苗活性氧积累、抗氧化系统及热激转录因子(HSF)和热激蛋白(HSPs)等的影响。结果表明: 黄瓜幼苗内源MT和Ca²⁺均受高温胁迫诱导;外源MT可上调常温下钙调素蛋白(CaM)、钙依赖蛋白激酶(CDPK5)、钙调磷酸酶B类蛋白(CBL3)、CBL结合蛋白激酶(CIPK2)mRNA表达;CaCl₂处理的MT合成关键基因色氨酸脱羧酶(TDC)、5-羟色胺-N-乙酰转移酶(SNAT)和N-乙酰-5-羟色胺甲基转移酶(ASMT)水平也显著升高,MT含量快速增加。MT和CaCl₂可显著增强高温下黄瓜的抗氧化能力,减少活性氧(ROS)积累,同时上调HSF7、HSP70.1和HSP70.11 mRNA表达,从而减轻高温胁迫引起的过氧化伤害,植株热害症状明显减轻,热害指数和电解质渗漏率显著降低。加入EGTA和CPZ后,MT对黄瓜幼苗抗氧化能力和热激蛋白表达的促进效应明显减弱,Ca²⁺对高温下黄瓜幼苗过氧化伤害的缓解效应也被p-CPA逆转。可见,MT和Ca²⁺均可诱导黄瓜幼苗的耐热性,二者在热胁迫信号转导过程中存在互作关系。     

复合碳源培养对酒糟厌氧消化液中丙酸互营氧化菌及群落结构的影响

丙酸累积是影响厌氧消化系统稳定性的主要因素,为了考察酒糟厌氧消化过程中间代谢产物的累积情况,以总固体含量(TS)（质量分数） 5%和7%的白酒糟为发酵原料进行了批次试验。结果表明,乙酸(最高浓度33~129 mmol/L)、丙酸(39~61 mmol/L)、丁酸(5~44 mmol/L)和15种氨基酸(0.01~0.3 mmol/L)为主要中间代谢产物。为了探究其中关键的丙酸降解菌群,以酒糟原始沼液JO为植种源,10 mmol/L丙酸和0.1 mmol/L混合氨基酸为复合碳源进行富集培养,获得中温厌氧丙酸-氨基酸培养系JO-AP。高通量测序分析表明,互营丙酸降解菌与厚壁菌门（Firmicutes）的丙酸厌氧降解菌（Pelotomaculum schinkii）近缘,16S rRNA基因相似性100%,占细菌总丰度的16.7%。对比酒糟原始沼液JO、丙酸培养系JO-P及丙酸-氨基酸培养系JO-AP中的主要功能菌群,发现采用单一碳源和复合碳源获得的优势互营丙酸降解菌不同;传统培养与分子生物学技术相结合可以更全面地掌握系统中的微生物群落组成。     

高温油藏生物膜内硫酸盐还原菌的腐蚀机理及防治策略

硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)广泛分布于高温、高压及高盐的石油油藏中,在油藏硫循环中起主导作用。SRB能在油藏生物膜内生长,有微量低分子有机酸时利用硫酸盐为电子受体并将其还原成硫化氢。硫化氢会腐蚀管道,导致原油泄露等其他安全问题,每年造成的经济损失超过7 000亿元。本文首先总结了油藏生物膜内微生物菌群多样性,分析了生物膜内SRB及其相关菌群的协同腐蚀机理;然后讨论了高温油藏SRB介导的硫氮氢生物地球化学循环过程、胞外电子传递机制及其腐蚀作用,并通过几个高温油藏SRB生物膜内腐蚀的现场案例进一步阐明了SRB的腐蚀机制。在此基础上,提出了应对高温油藏生物膜内SRB腐蚀的生物纳米防治策略,这为高温油藏管道防腐提供了新思路。     

稻纵卷叶螟幼虫驯化产生的热适应能力的继代效应

摘要: 【目的】在全球不断变暖背景下,昆虫受到热胁迫的频率不断增加。短期内反复受到热胁迫会使昆虫产生热适应性,但是昆虫热驯化所产生的耐热能力的传代效应还不完全清楚。稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis是水稻上的重要害虫,对其幼虫在特定温度下进行几代热锻炼可提高其对高温的适应能力。本研究旨在摸清稻纵卷叶螟热适应的传代能力,为在全球变暖形势下以温度因子预测其种群发展趋势提供指导。【方法】将实验室内分别经39℃和41℃连续锻炼30代建立的稻纵卷叶螟热锻炼品系HA39和HA41以及非锻炼品系HA27的1-5龄期幼虫在不同温度(36℃和41℃)下进行不同时长(1~144 h)的暴露处理,调查幼虫的存活率,确定热锻炼品系幼虫的耐热能力;采用两品系间杂交实验测定HA39和HA27各交配组合的繁殖力及后代3龄幼虫的耐热能力;对HA39停止高温锻炼,并测定停止锻炼2代后3龄幼虫的耐热能力。【结果】稻纵卷叶螟3龄幼虫经历多代次短期热锻炼不仅可提高该龄幼虫的高温适应力,而且可提高其他龄期幼虫对特定高温的耐受能力,表现为HA39和HA41在36或41℃下处理特定时长的存活率显著高于HA27。锻炼高温的不同,幼虫获得的热耐受能力也有差异。39℃下锻炼可提高4龄幼虫在36℃下暴露2和4 d以及5龄幼虫在41℃下暴露5和6 h时的存活率,但41℃下锻炼则不可。HA39和HA27的自交及杂交后代的繁殖力之间均无显著差异,杂交后代3龄幼虫在41℃下处理5和6 h时的存活率与HA39自交后代的相当,并且显著高于HA27自交后代的,幼虫通过热锻炼获得的耐热能力可从亲本遗传给后代。停止热锻炼2代后,在39℃下处理4 h时HA39 3龄幼虫的存活率显著高于HA27的,但39℃下其余处理时间以及36和41℃下处理1~7 h HA39 3龄幼虫的存活率均与HA27的无显著差异,表明幼虫热锻炼产生的耐热能力在停止锻炼后2代仍可部分保持。【结论】稻纵卷叶螟幼虫的热适应能力具有继代效应。经过长期的气候变暖适应后,稻纵卷叶螟种群的热适应能力很可能在不断增强,从而夏季高温对其种群的抑制作用减弱,其种群暴发频率增加。