鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.     

用鞘磷脂作为标志分子鉴定脂筏

脂筏是质膜双层中富含鞘脂、胆固醇及特殊蛋白质的质膜微区.对其功能的研究,首先要对其进行分离和鉴定.常利用密度梯度超速离心将其分离,然后以脂筏中富含的神经节苷脂GM₁作为标志分子,利用荧光或生物素标记的霍乱毒素-B亚基进行亲和标记来鉴定脂筏.但这一鉴定方法操作复杂、费时、易对环境造成污染,所用关键试剂霍乱毒素不易获得,再加上一些组织GM₁含量甚微或不含GM₁,使其应用受到局限.为建立一个特异性高又对各种组织广泛适应的脂筏鉴定方法.对两种细胞系脂筏的脂类组分进行了分析.结果发现,可用鞘磷脂作为脂筏的特异性标志分子,采用高效薄层层析技术对脂筏进行鉴定.     

遮荫对库拉索芦荟细胞超微结构和芦荟素含量的影响

分别用透射电子显微镜技术、高效液相色谱法研究了生长在遮荫和自然光照条件下库拉索芦荟叶片的超微结构和芦荟素含量.电镜观察结果表明,遮荫处理6个月后,库拉索芦荟叶片细胞中叶绿体基粒数量减少,类囊体片层数目减少且排列疏松,质体中原来积累的淀粉粒逐渐减少直至消失;内质网、高尔基体等内膜系统不发达.高效液相色谱分析结果显示,生长在遮荫条件下的库拉索芦荟叶片,芦荟素含量明显低于生长在自然光照下的含量.其中,遮荫下幼叶芦荟素的含量是自然光照下的63.33%,而成熟叶芦荟素含量仅有自然光照下的23.77%.无论自然光下还是遮荫条件下生长的芦荟,芦荟素的含量与叶龄有显著的负相关性,遮荫对成熟叶的影响更大.综合两方面的实验结果认为,遮荫首先影响芦荟叶片细胞内膜系统的发育,进而限制了芦荟素的合成和运输,使芦荟叶片中芦荟素含量降低.     

小地老虎谷胱甘肽-S-转移酶AiGSTs1的分子特性及其对杀虫剂胁迫的响应

[目的]鉴定小地老虎Agrotis ipsilon sigma家族谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因,明确其编码蛋白质的催化活性,阐明该基因在小地老虎不同发育期、不同组织及在毒死蜱和高效氯氟氰菊酯胁迫下的表达模式,为深入探究小地老虎GST在杀虫剂解毒代谢中的功能提供理论基础.[方法]利用同源检索方法从小地老虎转录组中鉴定GST基因,利用原核表达系统表达重组蛋白并使用试剂盒检测其活性,使用实时荧光定量PCR技术分析基因的表达模式.[结果]从小地老虎转录组中鉴定了一个编码sigma家族GST的cDNA序列,命名为AiGSTs1.其编码的AiGSTs1蛋白含有谷胱甘肽结合位点和底物结合位点,具有GSTs的典型特征.在大肠杆菌中成功表达了重组AiGSTs1蛋白,测得此蛋白不仅具有谷胱甘肽转移酶活性,还具有过氧化物酶活性.毒死蜱和高效氯氟氰菊酯均可抑制重组AiGSTs1蛋白的活性.AiGSTs1在供试的小地老虎不同发育期和组织中均有表达,但在蛹期和幼虫脂肪体中表达量最高.使用LD5o剂量毒死蜱和高效氯氟氰菊酯处理小地老虎幼虫后,AiGSTs1的表达水平显著上升.[结论]本研究明确了小地老虎AiGSTs1的序列、所编码蛋白的活性和表达模式.毒死蜱和高效氯氟氰菊酯能够诱导AiGSTs1表达水平上调,表明该基因可能在这2种杀虫剂的解毒代谢中起重要作用.     

HPLC法同时测定草苁蓉中草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B

为建立高效液相色谱法同时测定草苁蓉干燥全草中草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B的含量的分析方法,采用色谱柱:Klimail 100-5 C₁₈柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,以0.5%甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱条件:0~12 min,15%A;12~30 min,15%~20%A;30~40 min,20%~25%A;40~45 min,25%~30%A;45~60 min,30%~100%A;流速:1.0 mL·min^-1;检测波长:260 nm;柱温:30℃;进样量:20μL。得到草苁蓉纳拉苷的线性范围为4.688~150μg·mL^-1(R²=0.999 5);草苁蓉苷B的线性范围为3.438~110μg·mL^-1(R²=0.999 1);平均回收率分别为97.86%、96.55%;RSD分别为1.01、1.23(n=9)。本研究利用高效液相色谱法建立了同时测定草苁蓉全草中草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B两种组分的方法。方法学的验证结果证明,该方法简便、快捷,重现性好,可以用于草苁蓉中草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B两种组分的含量测定。     

若干苄基异喹啉类化合物的HPLC保留因子与抑制钙调素活性的关系

苄基异喹啉类化合物具有较强的拮抗钙调素的活性,测定这类化合物ＨＰＬＣ参数ＬｏｇＫ＇作为疏水参数与抑制钙调素的活性进行相关分析,结果表明活性随化合物亲脂性的增大而升高,二者较符合抛物线关系。     

t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

谷子初级核心种质生育酚的组分及其评价

利用高效液相色谱法(HPLC)对466份谷子初级核心种质资源进行了生育酚含量的测定与评价.结果表明:谷子子粒中生育酚总含量和(β+γ)-T的含量呈正态分布,α-T、δ-T的含量呈偏态分布,且(β+γ)-T是谷子生育酚的主要组成成分.在6大生态区中,淮河以南和西北内陆的生育酚总含量及(β+γ)-T的含量较高,而东北平原和西北内陆α-T的含量较高.同时发现黑色、褐色子粒生育酚及各组分的含量均高于其他粒色.文中对谷子种质资源生育酚及其组分含量的分布、分类进行了分析,并筛选出一批高生育酚含量和高α-生育酚含量的种质资源.     

蛇伤解毒散质量标准的研究

目的 建立蛇伤解毒散的质量标准.方法 采用显微鉴别法对制剂中大黄、黄芩、黄柏进行鉴别,用理化鉴别法对大黄进行鉴别,用薄层色谱法对大黄、黄柏进行鉴别,用高效液相色谱法对黄芩苷进行含量测定.结果 显微鉴别法可以鉴别大黄、黄芩、黄柏,理化鉴别法可以鉴别大黄,薄层色谱法可以鉴别大黄、黄柏,黄芩苷含量不少于15.0 mg/g.结论 建立的测定方法简便、准确,灵敏度高,重复性好,可用于蛇伤解毒散的质量控制.     

禽流感抗原基因NA,HA的克隆及其表达载体的构建

HA和NA是禽流感病毒重要的保护性抗原基因,为了得到禽流感植物疫苗,本试验采用高保真PCR扩增方法得到目的基因,分别克隆到pMD18-T载体.经测序证实核酸序列正确后,克隆到含有GUS基因的高效植物双元表达载体pB1121上,获得含有HA/NA基因的植物双元表达载体pB1121-HA和pB1121-NA,采用冻融法将含HA/NA基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌LBA4404,菌液浸染生菜子叶,共培48小时后进行GUS基因表达检测,x-glue染色显蓝色,说明带有HA/NA的植物双元表达载体构建成功,为下一步的生菜转HA/NA基因研究奠定基础.