t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

旋毛虫肌幼虫ES抗原的基因克隆及高效表达

作者对编码旋毛虫肌幼虫ES抗原的部分结构基因进行了克隆、鉴定和表达。用RNA PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫总RNA中反转录并扩增出0．7kh的靶DNA,酶切分析后将其克隆到融合表达载体pEx3lC中。SDS—PAGE电泳表明,含重组子的大肠杆菌能够表达出一分子量为37kDa的融合蛋白(P37),后者占菌体总蛋白的22%以上,并以包含体形式存在于菌体中。经对纯化后表达蛋白的ELlSA检测,证明它能被猪旋毛虫病阳性血清和抗旋毛虫单克隆抗体识别。研究结果揭示,重组蛋白P37对于研制旋毛虫病诊断抗原和免疫抗原具有潜在的应用价值。     

高效液相色谱法测定猫豆中左旋多巴的含量

本文用高效液相色谱法测定了猫豆中主旋多巴［Ｌｅｖｏｄｏｐａ］的含量。考察了加样回收率为９８．７０％,变异系数为１．９９％。     

聚焦色谱法测定肌型肌酸激酶亚型

报道了测定CK-MM亚型的聚焦色谱法,此法简单,快速,结果可靠,线性范围宽,最低检测限（8U／L）较正常参考值低,比国外报道的类似方法高6倍以上,分离度亦有改进.测定了20例健康人血清亚型分布,与文献报道结果相近.该法自动化程度高,已在急性心梗的诊断中实际应用.     

北京鸭血清HDL主要载脂蛋白的高效液相层析分离及其理化性质

用高效液相层析(HPLC)对北京鸭血清高密度脂蛋白(HDL)的所有载脂蛋白(apo)分离纯化,得五个主要apo峰,经SDS-PAGE鉴定,均为单一带;并做了IEF、糖基含量分析;对其中含量高的四个apo峰样进行了氨基酸组成测定和N-端部分氨基酸序列分析;从所做理化性质的研究,发现北京鸭血清HDL中的主要apo为:A-Ⅰ、C-Ⅲ_o、apoC-Ⅲ_s(s=1,2)、apoC's及可能的A-Ⅲ,几乎不含E和A-Ⅱ_o北京鸭HDL中apo的上述组成特点明显不同于易患动脉粥样硬化(As)的人及兔等动物,在一定程度上决定了北京鸭HDL的形成与代谢具有其特点,该特点与北京鸭不易形成As密切相关。     

SLE血清中抗-DNA抗体分离和性质的研究

本文用国产高分子树脂(T)接枝小牛胸腺DNA,通过亲合层析从系统性红斑狼疮SLE患者血清中纯化出抗-ds DNA抗体和抗-ss DNA抗体。酶联免疫吸附分析(ELISA)的研究表明:SLE抗-DNA抗体和DNA结合的差异性很大,是高度非均一性的。抗-ss DNA抗体不仅组成成分比抗-ds DNA抗体复杂,ss DNA/抗-ssDNA亲合能力也明显高于ds DNA/抗-ds DNA。纯化的抗-DNA抗体以IgG类抗体占主导,同时也有其它类型抗体存在(例如IgM等)。抗-ds DNA抗体有较抗-ss DNA抗体高的IgG含量(两者的IgG/IgM分别是7.0和4.0),说明IgG抗-DNA抗体更倾向于同dsDNA结合。     

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60～300μg的抗体含量范围内线性良好,r²≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%～106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%～20%,半乳糖相对含量≥2...     

聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成与特征

为探究聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成过程以及蛋白冠的形成对植物可能造成的影响,本研究选用3种平均粒径为200nm不同表面修饰的聚苯乙烯纳米塑料微球和新几内亚凤仙(Impatiens hawkeri)为对象,将3种聚苯乙烯纳米塑料分别与新几内亚凤仙的叶蛋白提取物进行反应,反应时间分别为2、4、8、16、24、36 h。利用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察其形貌变化,原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)进行表面粗糙度测定,使用纳米粒度和zeta电位分析仪测定水合粒径及zeta电位,液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴定蛋白冠的蛋白成分。从生物学过程、细胞组分以及分子功能3个方面对蛋白进行分类,研究不同表面修饰的纳米塑料对蛋白的吸附选择,探究聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成与特征,预测蛋白冠对植物造成的可能影响。结果表明：随着反应时间增加,纳米塑料的形貌变化越发明显,表现为尺寸和粗糙度的增加和稳定性的增...     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。