重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究

为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ细胞株用于高密度发酵,构建了多种分泌表达载体,在Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中作表达,研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高１０％左右。而载体整合方式、整合拷贝数、５’非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵,细     

黄热病病毒检测微阵列的研究制备

目的:制备黄热病病毒寡核苷酸检测微阵列.方法:根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出寡核苷酸探针用于制备基因芯片,克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因DNA经限制性显示技术扩增并标记,完成杂交后对芯片进行扫描和数据分析.结论:微阵列检测技术为检测黄热病病毒提供了一种早期、快速、可靠的方法,具有应用于临床检测的前景.     

肿瘤相关基因表达检测寡核苷酸芯片的制备及其初步应用

为研制肿瘤相关寡核苷酸芯片,并实现其在抗肿瘤反义核酸“癌泰得”作用机理研究方面的初步应用,制备了包含近450种肿瘤相关基因特异寡核苷酸探针的寡核苷酸芯片,建立了相应的质控标准.“癌泰得”用脂质体转染HepG2肿瘤细胞,提取细胞总RNA反转录并荧光标记cDNA,用制备的寡核苷酸芯片检测肝癌细胞HepG2的肿瘤相关基因表达水平,用软件分析获得其差异基因表达谱.0.4 μmol/L的反义核酸“癌泰得”作用于HepG2细胞15 h后,MDNCF、DHS等基因mRNA表达下调,MUC2、MPP11、LAT、HRIF-B、JNK3A1等mRNA基因表达上调,初步检测到了“癌泰得”的抗肿瘤作用可能的相关基因,为进一步的分子作用机理的探讨奠定基础.结果表明,制备的肿瘤相关芯片敏感度高、特异性高、重复性均较好,可用于检测肿瘤相关基因的表达谱,为临床诊断和基础研究提供了技术平台.     

利用Pichia pastoris生产S-腺苷甲硫氨酸的发酵工艺

在摇瓶中考察了重组Pichia pastoris发酵的诱导剂量,L-甲硫氨酸,以及pH对腺苷甲硫氨酸产量的影响.放大到3.7 L发酵罐和30 L发酵罐后,研究了重组细胞的发酵过程变化,对S-腺苷甲硫氨酸初步纯化.摇瓶中优化后的发酵条件是:每天添加1%甲醇诱导,L-甲硫氨酸为50mmol/L,培养基pH 5.0.培养144 h后SAM产量达到2.32 g/L.3.7 L发酵罐中发酵251 h后细胞浓度为120 g/L,SAM总量为15.18 g.放大到30 L发酵罐中,发酵225.5 h后细胞浓度约为120 g/L,SAM总量为145.05 g.纯化后SAM的纯度为93.5%,回收率为84.5%.     

应用多重标记引物增强寡核苷酸芯片的荧光信号强度

寡核苷酸芯片技术是一种高通量发掘和采集生物信息的强大技术平台,目前已广泛应用于生物科学领域 . 为改善寡核苷酸芯片的分析性能,对影响芯片杂交结果的因素,如片基表面的化学处理、探针的长度、间隔臂的长度、杂交条件等,进行了深入的研究和优化 . 对寡核苷酸芯片而言,仍有待解决的问题是如何产生更强的荧光信号来改善其检测灵敏度 . 利用两种类型的多个荧光分子标记的引物,来增强二维寡核苷酸芯片平面上的荧光信号强度 . 两种引物分别命名为：多标记线性引物和多标记分支引物 . 通过增加标记在目标 DNA 片段上的荧光分子数,可以显著增强寡核苷酸芯片上相应捕获探针的信号强度 . 实验表明,使用多标记引物能将所用的寡核苷酸微阵列的检测限 ( 以能够检测的最低模板量计算 ) 降低至单荧光标记引物的 1/100 以下,多重标记技术是一种有效增强微型化探针矩阵检测灵敏度的信号放大方法 .     

蛋白质芯片技术研究进展

蛋白质芯片技术是近年发展起来的一项新技术,这项技术是将蛋白质的分析微缩到小型芯片上进行,利用荧光或酶显色进行探测,最后用特 计算机软件加以分析。该技术在基因表达、抗原抗体检测、药物开发、疾病诊断等研究方面显示出快速、高效、高通量处理信息的能力。     

I组mGluRs反义寡核苷酸抗谷氨酸对小鼠大脑皮层神经元的兴奋毒作用

目的:研究I组代谢型谷氨酸受体(mGluRs)反义寡核苷酸对谷氨酸钠(Glu)引起的小鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用。方法:以细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出、光镜下细胞形态变化为指标,观察培养液中加入Glu引起的神经元损伤及mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸的保护作用;用免疫细胞化学检测神经元mGlulα仪和mGluR5表达。结果:实验显示0.1mmol.L-1的谷氨酸钠可明显造成神经元损伤,使LDH漏出增加(P<0.01),mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸6μmol.L-1和8μmol.L-1可明显拮抗Glu引起的神经元损伤,使LDH漏出显著减少(P<0.01);免疫组化实验证实体外培养神经元mGluRlα和mGluR5阳性表达。结论:mGluRl反义寡核苷酸和mGluR5反义寡核苷酸可对抗Glu引起的皮层神经元损伤。     

优化益生菌Lactobacillus casei Zhang高密度培养条件

为实现L. casei Zhang的高密度培养,在之前优化增殖培养基的基础上进一步寻求适宜该菌的培养条件。研究了不同中和剂、缓冲盐浓度、葡萄糖浓度、pH值控制、通气条件和补料分批培养对菌体在恒pH条件下发酵的影响,根据不同条件下菌体的比生长速率、菌体密度和活菌数情况,确定L. casei Zhang较适宜的高密度培养条件为：培养基葡萄糖浓度为80 g/L~100 g/L,以氨水为中和剂使pH保持5.9,采用间歇通氮气的方法保持环境厌氧,分批培养方式下37°C保温发酵10 h~12 h后,L. casei Zhang细胞干重达到7 g/L,活菌数3.5×1010 CFU/mL,比优化前提高7倍以上,能够满足益生菌制品生产要求的高菌体密度。     

高密度中心城区蓝绿空间冷岛效应及其影响因素——以北京五环路以内地区为例

蓝绿空间作为城市绿色基础设施的重要组成部分,对促进城市热环境健康、改善局地微气候具有重要作用。利用Landsat 8遥感影像、土地利用等数据,基于辐射传输方程算法、K均值聚类算法、相关性分析等方法,量化了典型的高密度中心城区--北京五环快速路以内地区的1199块1hm²以上的蓝绿空间冷岛效应的表征指标,并分析与蓝绿空间规模、形状复杂度、景观组成、环境组成、植被覆盖等要素的相关关系,还根据蓝绿空间的不同降温特性进行分类,探讨每类蓝绿空间在缓解高密度中心城区热岛效应中的独特作用、优势与机制。结果表明：（1）蓝绿空间的规模、形状复杂度、景观组成等景观要素与冷岛效应的关系显著,如总面积、绿地面积和水体面积与降温幅度、降温范围、降温服务呈显著正相关,与降温效率和降温速率呈显著负相关;周长与降温范围、降温服务呈显著正相关,与降温效率和速率呈显著负相关;周长面积比与降温幅度和降温服务呈显著负相关,与降温效率和蓝绿空间自身温度呈显著正相关,而形状指数则与降温范围和降温服务呈显著正相关。（2）蓝绿空间的环境要素与冷岛效应也存在相关关系。蓝绿空间之间会产生冷岛效应的协同与促进现象,蓝绿空间降温范围内的其他蓝绿空间的总面积与该蓝绿空间的降温幅度、降温范围、降温服务和辐射距离呈显著正相关,与蓝绿空间自身温度呈显著负相关。（3）蓝绿空间的总面积、水体面积、周长与降温幅度之间,周长面积比与降温效率之间存在阈值,为节约土地资源、保证降温效果,建议不应过多超过阈值。（4）基于蓝绿空间在降温幅度、效率、辐射距离等方面的差异,将蓝绿空间划分为4类。高密度中心城区蓝绿空间规划建设应充分评估区域降温需求,了解蓝绿空间降温现状,合理配置具有不同降温特性和优势的蓝绿空间,在土地和资金有限的情况下,充分发挥各类蓝绿空间的冷岛效应。本研究有助于政府和规划师摸清当前蓝绿空间冷岛效应的现状、问题和发展潜力,对理论和实践具有一定参考意义。     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。